Montage, laden, en uitlijning van een Analytical Ultracentrifuge Sample Cell
5 november 2009
De analytische ultracentrifuge (AUC) monster cel houdt monster en referentie-buffer en tijdens de experimenten en wordt blootgesteld aan een hoog vacuüm en rotor met snelheden tot 60.000 tpm. Deze video zal aantonen aan de strenge aandacht voor detail nodig is voor de montage, laden en afstemming van deze zeer belangrijke component van een AUC experiment.
Hoi, ik ben Andrea Balbo. Ik werk in de groep van Peter Shucks bij de National Institutes of Health. In deze video gaan we u onze procedures laten zien voor de assemblage, het laden en de rotoruitlijning van een monstercel voor een analytische ultracentrifuge.
Laten we beginnen. Hier zijn de componenten van een monstercel voor analytische ultracentrifugatie. In de behuizing van de cel is een dubbelgesectoreerde koolstofveld-epon middenstuk van 12 millimeter geplaatst, dat tussen twee vensterassemblages wordt geklemd. Elke vensterassemblage bestaat uit een vensterpakking, een venstervoering en een venster dat in de vensterhouder is bevestigd.
Deze onderdelen worden vervolgens in de celbehuizing geschoven door hun sleutelbanen uit te lijnen met de sleutel in de behuizingshuls; een behuizingspakking en vervolgens een schroefring sluiten de monstercel af met een aandraaimoment tussen 120 en 140 inch pounds. Na het laden van uw monster worden twee behuizingsstop-pakkingen en een behuizingsstop gebruikt om de vulgaten van de cel af te dichten om scanartefacten, lekken en breuk tijdens experimenten te voorkomen. Het is essentieel dat alle componenten schoon, droog, stofvrij en in de best mogelijke staat zijn; controleer deze regelmatig en vervang ze indien nodig. U heeft daarnaast het volgende nodig: een analytische ultracentrifuge, een titanium viergatsrotor, een laboratoriumbalans, een momentsleutel met een afleesbare wijzerplaat en een momentstandaard, een contragewicht en contragewichten, een platte schroevendraaier, een pincet, een 200 µL pipetteur voorzien van een lange taps toelopende pipetpunt, uitlijn工具 en spin-coat glijmiddel.
We beginnen met de constructie van de monstercel door twee raamassemblages samen te stellen. Plaats eerst een raampakking op de bodem van de raamhouder. Positioneer vervolgens de raamvoering, soms ook raamkussen genoemd, in de raamhouder zodanig dat de opening van de voering onder een lichte hoek tegenover de spiebaan van de houder staat.
Plaats vervolgens het venster in de houder, waarbij de kraslijn op het venster wordt uitgelijnd met de sleutelgatuitsparing van de vensterhouder. Druk voorzichtig naar beneden op de uiterste randen aan beide zijden van het venster. Om een goede afdichting en een nauwkeurige werking van de monstercel te garanderen, brengen we een dunne laag coating aan op de behuizingspakking in de schroefring.
Smeer met behulp van spin-coat smeermiddel een zeer kleine hoeveelheid spin-coat uit tussen uw duim en wijsvinger. Bedek de schroefdraad van de schroefring met een dunne, onzichtbare laag spin-coat. Smeer op dezelfde wijze de behuizingsafdichting.
Veeg alle zichtbare smeermiddelen weg. Om te beginnen met de montage van de monstercel: schuif één venstereenheid met het venster naar boven naar u toe in de celbehuizing door de spiebaan uit te lijnen met de spie van de behuizing.
Lijn de spiebaan van het middenstuk uit met de spie van de behuizing en laat het voorzichtig op de raamassemblage binnen in de behuizing vallen. Gebruik nooit een instrument om het middenstuk in de celbehuizing te duwen. Dit kan permanente schade aan het middenstuk veroorzaken, wat kan leiden tot lekkages tijdens experimenten.
Draai de tweede raamset zo dat het raam naar het middenstuk is gericht en van u af staat. Lijn de spiebaan uit met de behuizingssleutel en schuif deze over het middenstuk naar beneden. Plaats de behuizingspakking erbovenop.
Draai vervolgens een schroefring aan tot het woord 'out' zichtbaar is. Doe dit met de vingers. Gebruik daarna een uitlijningstool om de schroefring handvast aan te draaien.
Soms schuift het middenstuk niet gemakkelijk in de behuizingshuls. U kunt het eerst uitlijnen en vervolgens de tweede raamunit daarop plaatsen. Oefen daarbij een zachte neerwaartse druk uit op de raamunit.
Beide kunnen tegelijkertijd in de celbehuizing worden geschoven. Op deze manier voorkomen we dat er direct op het middenstuk wordt gedrukt. Dit is een goed moment om de cel te controleren op stof, pluisjes en vingerafdrukken.
U zult ook Newton-ringen opmerken, die aangeven dat er nog lucht aanwezig is tussen het middelpunt en de vensters. Deze zullen verdwijnen nadat u de schroefring naar boven heeft aangedraaid en het woord 'out' zichtbaar is. Plaats de monstercel volledig in de cel.
Klem de klemring van het momentsleutelstation. Houd de cel op zijn plaats door constante druk uit te oefenen op de hendel van het momentsleutelstation. Draai de schroefring in één vloeiende beweging aan tot een koppel van tussen 120 en 140 inch pounds.
Laat de hendel van het koppelstandaard los en verwijder voorzichtig de monstercel. We laden gewoonlijk een volume van 400 µL in elke sector van het 12 mm middelpunt. Positioneer de monstercel met een 200 µL pipet zodanig dat de vulgaten naar boven wijzen en het woord 'out' op de schroefring zichtbaar is.
Schuif de pipetpunt tot halverwege in het linker middensegment via de vulopeningen en laat langzaam 200 µL referentie-oplossing uitvloeien. Herhaal dit eenmaal voor een totaal van 400 µL, waarbij zorgvuldig en langzaam dezelfde pipetpunt en dezelfde techniek worden gebruikt. Vul het rechter middensegment met 400 µL monsteroplossing.
Het is essentieel om de volumes van de referentie- en monsteroplossingen zo nauwkeurig mogelijk op elkaar af te stemmen. Het stevig plaatsen van de pipetpunt op de pipet, het langzaam opzuigen en uitpipetteren van de oplossingen, het vermijden van luchtbellen en het gebruik van dezelfde pipetpunt voor beide oplossingen dragen er allemaal aan bij om de volumes gelijk te houden om de cel te verzegelen.
Plaats twee rode afdichtingsringen voor de behuizingspluggen nauwkeurig in elk vulgat, waarbij u erop let dat ze zorgvuldig tussen het middenstuk en de aluminium behuizing zijn gepositioneerd. Dek elk vulgat af met een behuizingsplug en draai deze handvast met een kleine platte schroevendraaier. Controleer vóór het laden van de rotor of het contragewicht en de cel die tegenover het contragewicht wordt geplaatst, een gewichtsverschil van maximaal 0,5 gram hebben.
Begin met een balans die op nul staat. Weeg eerst een monstercel die tegenover het contragewicht zal worden geplaatst. Tareer de balans om het gewicht van de monstercel af te trekken.
Weeg vervolgens het contragewicht. In dit geval stellen we vast dat het contragewicht 4,193 gram lichter is dan de monstercel. Selecteer een contragewicht van vier gram en schroef dit in het bevestigingsgat van het contragewicht, waarbij u erop let dat het niet boven de bovenkant uitsteekt.
Weeg het contragewicht om er zeker van te zijn dat het uiteindelijke gewicht binnen 0,5 gram nauwkeurig is. Plaats het contragewicht met een rotor met vier gaten in positie vier, zodat de witte pijl zichtbaar is en in de richting van de centrifugale kracht wijst. Controleer met een uitlijningsinstrument of het volledig in de rotor is geplaatst.
Plaats de balanceercel met de behuizingspluggen naar het midden van de rotor gericht en het woord 'out' op de schroefring zichtbaar. Controleer opnieuw met een uitlijningstool of deze volledig in de rotor is gezakt. Bekijk dit vanuit de onderzijde van de rotor.
Lijn de binnenzijde uit. Markeer met een kraspen het streepje dat zich het dichtst bij het centrum van de rotor bevindt met het krasteken op het contragewicht met behulp van een uitlijningstool. Lijn op dezelfde wijze de monstercel op positie twee uit.
Nadat alle cellen zijn uitgelijnd, is de rotor klaar om in de centrifugekamer te worden geplaatst.
Overzicht
Deze video demonstreert de assemblage, het laden en de uitlijning van een monstercel voor analytische ultracentrifugatie (AUC), wat cruciaal is voor AUC-experimenten. Er wordt nadruk gelegd op de juiste behandeling en voorbereiding van de componenten van de monstercel om nauwkeurige resultaten te garanderen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Analytische ultracentrifugatie
- Biofysische methoden
- Technieken voor monsterpreparatie
Achtergrond
- De AUC-monstercel is essentieel voor het uitvoeren van experimenten bij hoge rotorsnelheden.
- Deze bestaat uit meerdere componenten die met precisie moeten worden geassembleerd.
- Het handhaven van netheid en een juiste uitlijning is cruciaal om experimentele artefacten te voorkomen.
- Inzicht in het assemblageproces is van vitaal belang voor onderzoekers die AUC gebruiken.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerde handleiding te bieden voor het assembleren en laden van een AUC-monstercel.
- Om het belang van zorgvuldige voorbereiding bij AUC-experimenten te benadrukken.
- Om ervoor te zorgen dat onderzoekers het proces nauwkeurig kunnen reproduceren.
Gebruikte methoden
- Assemblage van de raammodules en het middenstuk in de monstercel.
- Aanbrengen van een koppel om de componenten van de monstercel te fixeren.
- Inbrengen van referentie- en monsteroplossingen in de cel.
- Balanceren van de monstercel met een contragewicht voor nauwkeurige metingen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle assemblage van de AUC-monstercel zoals gedemonstreerd in de video.
- Correcte laadtechnieken waarborgen een minimaal aantal bellen en gelijke volumes.
- Aanpassingen van het contragewicht zijn cruciaal voor nauwkeurige rotorprestaties.
- Visuele indicatoren, zoals Newton-ringen, helpen bij het beoordelen van de assemblagekwaliteit.
Conclusies
- Aandacht voor detail bij de assemblage van de monstercel is essentieel voor AUC-experimenten.
- Het volgen van de beschreven procedures kan de betrouwbaarheid van de experimenten verhogen.
- Regelmatig onderhoud en inspectie van de componenten worden aanbevolen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Een juiste montage en uitlijning van monstercellen voor analytische ultracentrifugatie zijn essentieel voor het genereren van betrouwbare biofysische gegevens over de grootte, vorm, zuiverheid en oligomerisatietoestanden van eiwitten. Een zorgvuldige voorbereiding van de monstercel minimaliseert experimentele artefacten, waardoor de gegevensintegriteit voor targetvalidatie en mechanistische studies in de vroege fase van geneesmiddelenontwikkeling wordt gewaarborgd. Deze procedurele striktheid ondersteunt het voorspellend vertrouwen in downstream screening- en lead-optimalisatieworkflows.
Strategische toepassingen in BioPharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt nauwkeurige bepaling van proteïnoligomerisatietoestanden en proteïne-proteïne-interacties mogelijk, wat direct bijdraagt aan hypothesen voor targetvalidatie.
- Operationele waarde: Biedt een labelvrije, in oplossing gebaseerde beoordeling van macromoleculaire eigenschappen onder bijna-natuurlijke condities.
- Voorspellende waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij target-de-risking door het leveren van kwantitatieve sedimentatiecoëfficiënten en vormparameters.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert gegevens over hydrodynamische grootte en vorm die essentieel zijn voor de formulering van assaybuffers en stabiliteitsscreening.
- Operationele waarde: Waarborgt de integriteit en monodispersiteit van monsters, wat cruciaal is voor reproduceerbare biochemische en celgebaseerde assays.
- Platformintegratie: Ondersteunt de biofysische karakterisering van gezuiverde targets voorafgaand aan high-throughput screeningcampagnes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Maakt beoordeling mogelijk van de vorming van proteïnecomplexen en conformationele veranderingen die relevant zijn voor ziekteprocessen.
- Operationele waarde: Ondersteunt consistentiecontroles tussen verschillende batches van recombinante proteïnen die worden gebruikt in preklinische modellen.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen biofysische targetkarakterisering en functionele assays in ziekterelevante systemen.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De workflow van de monstercel van de analytische ultracentrifuge is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie tot leadidentificatie, en levert biofysische resultaten die go/no-go-beslissingen informeren op basis van het gedrag en de stabiliteit van het target.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van target-oligomerisatie en interactienetwerken, wat biologische risicovermindering mogelijk maakt voorafgaand aan de assayontwikkeling.
- Screening: Waarborgt de monodispersiteit en stabiliteit van het target, wat een directe impact heeft op de assay-gereedheid en datakwaliteit in screeningcampagnes.
- Analytics: Genereert kwantitatieve sedimentatiecoëfficiënten en molecuulgewichtmetingen waarmee proteïnestaten onder verschillende condities vergeleken kunnen worden.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt de biofysica van het gezuiverde target met functionele validatie in preklinische modellen door een consistente materiaalkwaliteit.
- Enterprise Hergebruik: Vertegenwoordigt een gestandaardiseerde, herbruikbare capaciteit voor biofysische karakterisering over meerdere targets en projecten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid van doeleigenschappen, vermindering van mechanistische ambiguïteit en verbeterde striktheid van targetvalidatie.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde monstervoorbereiding, reproduceerbaarheid tussen runs en schaalbaarheid over laboratoria heen.
- Strategische waarde: Beter geïnformeerde go/no-go-beslissingen, lagere faalpercentages door targetinstabiliteit en verbeterde kapitaalefficiëntie in de vroege ontdekkingsfase.
- Impact op de portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering van targets op basis van biofysische de-risking-data.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in biofysische technieken en nauwkeurige behandeling van optische componenten.
- Afhankelijk van analytische ultracentrifuge-instrumentatie, momentsleutels, uitlijningsgereedschap en cleanroom-compatibele monsterbehandeling.
- Noodzaakt standaardisatie tussen teams van protocollen voor reiniging, assemblage en het aanbrengen van het koppel.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen aan verschillende monstertypes, buffercondities en geometrieën van het middelpunt.
- Beperkt door de kwetsbaarheid van componenten; vensters en middelpuntstukken zijn gevoelig voor beschadiging door partikels, onjuist koppel of verkeerde uitlijning.
