Zuivering van specifieke cel Bevolking naar fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting (FACS)

Hallo, ik ben Hope Campbell, specialist in flowcytometrie van het Blood Research Institute bij het Blood Center of Wisconsin. Hallo, ik ben STR Baso, promovendus in het lab van Dr. Bonnie Dieter. Ik ben ook verbonden aan het Blood Research Institute van het Blood Center of Wisconsin.

Vandaag gaan we een procedure uitvoeren voor het isoleren van cellen met behulp van fluorescent-geactiveerde cel sortering. We gebruiken deze procedure in het laboratorium om de functie van lymfocyten en myeloïde celpopulaties te bestuderen. Laten we beginnen.

In deze procedure worden B- en CD4 T-cellen gezuiverd uit muis-splenocyten. Het startaantal doelcellen moet worden berekend op basis van het benodigde aantal cellen en de herstelgraad van het apparaat bij gebruik van deze methode. De typische herstelgraad voor B- en CD4 T-cellen is 85 tot 90%. De startpopulatie splenocyten bestaat uit ongeveer 60 tot 70% B-cellen en 20 tot 30% T-cellen.

Als u dus start met 100 × 10⁶ cellen, kunt u 50 tot 60 miljoen B-cellen en 20 tot 30 miljoen T-cellen terugwinnen voordat u begint met het sorteren. De oplossingen en reagentia die nodig zijn voor het protocol moeten op ijs worden geplaatst. Deze omvatten een kleuringsbuffer bestaande uit fosfaatgebufferde zoutoplossing met 3% foetaal kalfsserum, een suspensiebuffer bestaande uit 25 millimolaire HEPES bereid in Hank's balanced salt solution of HBSS met 3% foetaal kalfsserum, een 25 millimolaire HEPES-oplossing bereid in foetaal kalfsserum, kleuringsantilichamen en compensatiekralen.

Voor dit protocol zijn ook de volgende benodigdheden en reagentia vereist: conische buizen van 15 milliliter, polystyreen of polypropyleen flowbuizen van 12 bij 75 millimeter, een nylon cell strainer, trypaanblauw en een hemocytometer. Daarnaast moeten verzamelbuizen voor het sorteren vooraf worden klaargezet om dit uit te voeren.

Voeg 300 µL van de HEPES-FCS-oplossing toe aan flowtubes of 1 mL van de HEPES-FCS-oplossing aan 15 mL conische buizen. Deze moeten op ijs worden bewaard tot het verzamelproces begint. Begin met het maken van een enkelcel-suspensie van de gewenste celpopulatie.

Indien de met deze procedure geïsoleerde cellen zullen worden gekweekt, moet de volledige celpreparatie in een weefselkweekkast worden uitgevoerd. Was de cellen eenmaal met behulp van steriele technieken door ijskoud kleuringsbuffer toe te voegen en resuspendeer de cellen door de buis meerdere keren om te keren.

Centrifugeer de cellen vervolgens gedurende zeven tot acht minuten bij ongeveer 250 ×g bij 4 °C. De wascondities kunnen variëren afhankelijk van het celtype en de concentratie. Was voor cytes tot 200 × 10⁶ cellen met 10 mL kleuringsbuffer.

Verwijder voorzichtig het supernatant door aspiratie, zodat het celpellet intact blijft. Resuspendeer de cellen vervolgens in ijskoude kleuringsbuffer tot een concentratie van maximaal 50 × 10⁶ per 100 µL. Resuspendeer het celpellet door tegen de buis te tikken of door deze voorzichtig te vortexen.

Breng vervolgens 0,25 tot 1 x 10⁶ van de zes cellen over naar een nieuwe polystyrene of polypropylene flowtube van 12 bij 75 millimeter op ijs. Zet deze apart om later als ongekleurde controlemonster te gebruiken. Voeg aan de eerste tube primaire antilichamen toe aan de celsuspensie om de gewenste eindconcentratie te bereiken. Hier worden PE Texas Red-geconjugeerde anti-B220-antilichamen gebruikt om B-cellen te kleuren, terwijl ZF-geconjugeerde anti-TCR β en/of 700-geconjugeerde anti-CD4-antilichamen worden gebruikt om T-cellen te kleuren. Meng door tegen de onderkant van de tube te tikken of door licht te schudden.

Vortex vervolgens, plaats de cellen op ijs en laat deze 20 tot 30 minuten in het donker incuberen. Was na de incubatie de gelabelde cellen door resuspendering in 10 milliliter ijskoud suspensiebuffer en centrifugeer zoals voorheen, na zorgvuldige verwijdering van het supernatant. Herhaal deze stap om de cellen een tweede keer te wassen.

Resuspendeer de cellen tot slot in ijskoud suspensiebuffer. Als de primaire antilichamen niet direct geconjugeerd zijn aan een fluorofoor, voeg dan gelabelde secundaire antilichamen of streptavidine-conjugaat toe aan de celсусpensie en incubeer de cellen vervolgens opnieuw op ijs in het donker gedurende 20 tot 30 minuten na de incubatie. Was de cellen tweemaal met ijskoud suspensiebuffer.

Resuspendeer de cellen in ijskoud suspensiebuffer. Bepaal de celconcentratie en viabiliteit met behulp van een vitale kleurstof zoals trypaanblauw en een hemocytometer. Pas de celconcentratie aan naar 10 tot 20 × 10⁶ cellen per milliliter door suspensiebuffer toe te voegen, om te voorkomen dat de FACS-machine verstopt raakt door celaggregaten die mogelijk tijdens de isolatie zijn afgestorven.

Procedure en kleuring. Filtreer de cellen onmiddellijk voor aanvang van het sorteerprotocol door een drukzeef. De poriegrootte van de zeef moet worden gekozen op basis van het celtype; voor cytes wordt een zeef met een poriegrootte van 40 micrometer gebruikt.

Verzamel de gefilterde cellen in een conische buis van 15 liter of in flow-buisjes van 12 bij 75 millimeter, afhankelijk van het volume. Plaats de cellen op ijs terwijl de cytometer wordt klaargezet voor de sorteerprocedure. Indien BD comp beads als enkelkleurige positieve controles worden gebruikt, bereid dan één controlebuis voor voor elke kleur die in de assay wordt gebruikt, plus een ongekleurde negatieve controlebuis.

Nadat de kraal-suspensies grondig zijn gevortexd, voegt u voor elke gebruikte kleur en voor de negatieve controle één druppel van zowel de negatieve als de positieve kraal-suspensie toe aan 100 µL suspensiebuffer. Voeg vervolgens één µL van het gelabelde antilichaam toe aan elke buis met positieve controle. In dit experiment wordt één buis voorbereid met PE Texas'Red B twee 20 antilichamen.

Meng één monster met ETCR beta-antilichamen en één monster met lor 700 CD four-antilichamen door tegen de bodem van de buisjes te tikken en laat dit 15 tot 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur incuberen. Was de beads één keer met 2 mL kleuringsbuffer en centrifugeer 10 minuten bij 200 Gs. Verwijder het supernatant via aspiratie en resuspendeer de bead-pellet in 200 tot 500 µL kleuringsbuffer.

De configuratie van de buffer van de flowcytometer varieert per fabrikant en mag uitsluitend worden uitgevoerd door 적절 getraind personeel. De hier beschreven procedure voor cel sortering zal worden uitgevoerd met de BD FACSAria. Selecteer vóór het sorteren de juiste nozzle, afhankelijk van het te sorteren celtype.

De beschikbare maten voor de facts aria zijn 70 micrometers, 100 micrometers en 130 micrometers. De spuitgatenmaat moet ten minste drie keer de grootte zijn van de te sorteren cel; voor lymfocyten wordt daarom het spuitgat van 70 micrometer geselecteerd. Aseptische celsortering kan worden uitgevoerd met de aseptische sorteeroptie van het instrument.

Bij gebruik van deze optie wordt het gehele sheath-traject gedecontamineerd met 70% ethanol volgens de instructies van de fabrikant. Zorg ervoor dat de sheath-filters worden vervangen en dat de PBS wordt vervangen door steriele PBS. Zodra de cytometer gereed is, plaatst u de vooraf gekoelde opvangbuisjes met heaps FCS in het juiste opvangapparaat.

Beschikbare opvangesystemen kunnen tot twee conische buizen van 15 milliliter bevatten. Vier buizen van 12 bij 75 millimeter of vier microtubes. Gebruik buizen van 12 bij 75 millimeter voor het opvangen van minder dan 1,5 × 10⁶ cellen en conische buizen van 15 milliliter voor het opvangen van 1,5 × 10⁶ tot 4,5 × 10⁶ cellen.

Plaats het juiste opvangvat in de sorteeropvangkamer. Leid bij multicolor sorteringen de zijstromen naar het geïnstalleerde opvangvat. De cytometer moet eerst worden gekalibreerd om rekening te houden met de spectrale overlap tussen de detectoren.

Het hier getoonde voorbeeld illustreert de overlap tussen de emissiespectra van fit E en pe. Deze overlap, weergegeven in het donker gearceerde gebied, wordt spillover genoemd. In dit geval zou PE-spillover worden gedetecteerd in het fit E-kanaal en fit e-spillover in het PE-kanaal.

Deze spillover moet worden gecorrigeerd om de residuele fluorescentie van één fluorofoor in een ander kanaal te elimineren. Het proces van het corrigeren voor de spillover wordt compensatie genoemd; voer handmatige compensatie uit. Gebruik cytometry-software om een sjabloon op te stellen dat een bivariaat plot bevat om de forward scatter FSC en side scatter SSC weer te geven, evenals één histogram voor elke gebruikte fluorofoor.

De methode voor het instellen van deze plots varieert afhankelijk van de software. Plaats de buis met de negatieve controle in de laadpoort van de cytometer en start de gegevensverwerving terwijl het monster wordt geanalyseerd. Pas de FSC en SSC aan om de populatie van belang binnen de schaal te plaatsen.

Pas vervolgens de fluorescentie-PMT-instellingen aan zodat de negatieve populatie of autofluorescentie in het uiterste linkergedeelte van het histogram komt te staan. Registreer de negatieve controlebuis. Verwijder de negatieve controlebuis uit de laadpoort van de cytometer en vervang deze door de eerste positieve controlecom-buis.

Begin nu met de acquisitie. Herhaal dit proces voor elk van de buizen met positieve controle en leg de gegevens voor elke buis vast. Trek voor elke positieve controle een intervalgate of een kader rond de gebeurtenissen die op het histogram zijn geregistreerd.

Teken vervolgens een tweede intervalgate in het negatieve gedeelte van het histogram. Houd bij handmatige compensatie rekening met elke fluorofoor die in het experiment is gebruikt door de mediaan van de positieven aan te passen totdat deze gelijk is aan de mediaan van de negatieven. Pas de waarden voor spectrale overlap aan, naar boven of naar beneden, totdat de medianen voor elke fluorescentieparameter zo nauwkeurig mogelijk overeenkomen.

Bereid de sorteerprocedure voor door de gate-instellingen voor het experimentele monster te bepalen, gebruikmakend van de instellingen die zijn vastgesteld met de positieve en negatieve controlemonsters. Plaats de buis met de te sorteren cellen in de laadpoort van de cytometer en start de acquisitie met een snelheid van 9.000 tot 10.000 events per seconde. Selecteer een dot plot om forward scatter tegenover side scatter weer te geven.

Forward scatter is een algemene indicator voor de celgrootte en wordt op de x-as geplaatst, terwijl side scatter een indicator is voor de celgranulariteit en op de Y-as wordt geplaatst. Gate nu de populatie van belang. Zodra de gates zijn bepaald, controleer dan of de temperatuur van de laadpoort van de cytometer is ingesteld op 4 °C.

Plaats vervolgens de experimentele monsterbuis in de laadpoort. Druk op de sorteeroptie en start de acquisitie; de opvangbuisjes moeten op ijs worden geplaatst terwijl ze worden gevuld. Ga door met sorteren totdat het gewenste aantal cellen is verzameld of totdat de monsterbuis leeg is.

Stop vervolgens het sorteren door opnieuw op de sorteerknop te drukken en verwijder het monster uit de laadpoort. Plaats daarna de opvangbuis direct op de laadpoort van de cytometer en verzamel 500 tot 1000 events. Met gebruik van dezelfde instellingen als bij het sorteren van T-cellen, verhoogde de sorteerprocedure de zuiverheid van 21 naar 99%. Voor B-cellen werd de startpopulatie van 5% verhoogd naar 98% na het sorteren.

We hebben zojuist gedemonstreerd hoe B- en T-celpopulaties uit leukocyten kunnen worden gezuiverd via FACS. Onthoud dat FACS kan worden gebruikt om elke celpopulatie te zuiveren, mits er een enkelcel-suspensie kan worden gegenereerd en de juiste antilichamen beschikbaar zijn. Daarnaast kunnen cellen die genetisch zijn gemarkeerd met fluorescente markers eenvoudig worden gezuiverd zonder gebruik van antilichamen.

Vergeet daarnaast niet om altijd de juiste controles voor uw experimenten te gebruiken en controleer altijd de laserconfiguratie van uw flowcytometer om er zeker van te zijn dat u de correcte fluorochromen gebruikt; zorg er bovendien voor dat u geschikte gates hanteert zodat deze uw populaties correct omsluiten. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.