Cellulaire Encapsulation in 3D Hydrogelen voor Tissue Engineering

Het stapsgewijze proces voor het inkapselen van cellen begint met de preparatie en sterilisatie van hydrogelvormen en andere materialen, gevolgd door de isolatie van cellen in individuele populaties, in buisjes voor elke gelset. De gelering wordt vervolgens uitgevoerd in aanwezigheid van cellen, gevolgd door de in vitro of in vivo incubatieperiode. Latere analyses van het celgedrag kunnen tests voor viabiliteit, morfologie, proliferatie en differentiatie omvatten.

Hoi, ik ben Amidio Kahan uit het laboratorium van Dr. Jason Burdick van de afdeling Bioengineering aan de University of Pennsylvania. Vandaag laten we u een procedure zien voor cellulaire inkapseling in 3D-hydrogels voor tissue engineering. We gebruiken deze procedure om de effecten van de compositie en structuur van de hydrogel op het gedrag van ingekapselde cellen te bestuderen.

Laten we beginnen. Om deze procedure te starten, bereidt u een 0,5% gewichtsoplossing van de foto-initiator Irgacure 2959 in PBS. Meng en incubeer gedurende twee tot drie dagen in het donker bij 37 °C.

Gebruik, zodra deze klaar is, een spuitfilter om de oplossing te steriliseren en bewaar deze bij kamertemperatuur. Gebruik vervolgens een spreadsheetprogramma zoals Microsoft Excel om de benodigde hoeveelheid polymeer en crosslinker te berekenen zoals gedemonstreerd. Hier is hyaluronzuur gefunctionaliseerd met acrylaat-reactieve groepen.

Bereken ook de hoeveelheid van het hangerpeptide dat het functionele adhesiedomein bevat met de aminozuren cysteïne, arginine, glycine en aspartaat. De cysteïne dient voor de koppeling aan het polymeer. Nu de vereiste hoeveelheden polymeer-crosslinker en peptide zijn bepaald, kunnen deze worden afgewogen en in afzonderlijke eppendorfbuisjes worden geplaatst.

Pas het berekeningsblad dienovereenkomstig aan. Voor de werkelijke massa van het verkregen polymeer gaat u door naar het voorbereiden van de gelmallen. Gebruik een scheermesje om de uiteinden van de individueel verpakte steriele tips af te snijden.

Wegwerpspuiten van één milliliter. Zorg ervoor dat er een vlakke snede wordt gemaakt voor de mallen die worden gebruikt voor fotopatronen in gels. Steriliseer tot slot de spuitmallen, de EOR-buizen met open doppen en alle andere benodigde materialen door ze gedurende 30 minuten onder een kiemdodende lichtbron in de biologische veiligheidskast te plaatsen.

Zodra de sterilisatie is voltooid, gaat u over tot het voorbereiden van de cellen na sterilisatie van de experimentele apparatuur. Werk in de zuurkast en voeg steriele TEA toe aan het polymeer dat wordt gebruikt voor de mical-type crosslinking en steriele PBS aan het polymeer dat wordt gebruikt voor de vrije radicaal-crosslinking. VOEG de bijbehorende buffer toe aan de buisjes met de pendant moiety en vortex deze.

Om de hanger-eenheid te binden aan het gealkyleerde hyaluronzuur via een thiol van een INE-groep op het peptide om de hanger-eenheid aan het polymeer te bevestigen, voegt u deze toe aan de polymeeroplossing en sluit u deze af met parafilm. Vortex kortstondig en incubeer bij 37 °C onder menging. Terwijl de hanger-eenheid zich bindt, bereidt u de cellen voor die ingekapseld moeten worden, zoals humane mesenchymale stamcellen of HMSC's, door ze te wassen met PBS.

Incubeer vervolgens één minuut met trypsine bij kamertemperatuur, verwijder de trypsine en incubeer nog vijf minuten bij 37 °C. Voeg daarna HMSC-groeimedium toe om de trypsine te neutraliseren en de cellen van het platoppervlak los te maken. Tel de cellen met een hemocytometer.

Verdeel de getelde cellen in porties met het juiste aantal voor elke set gels. Voor een set van drie 50 µL gels met een dichtheid van 10 miljoen cellen per milliliter, brengt u 1,5 miljoen cellen over naar een individuele conische buis. Bereid vanwege de timing van de procedure niet meer dan vier gels in een individuele set.

Centrifugeer de cellen vervolgens gedurende zes minuten bij 500 RCF. Terwijl de cellen sedimenteren bij kamertemperatuur, bereidt u het polymerisatiemengsel voor de mical edition crosslinking. Voeg buffer toe aan de crosslinker om de juiste concentratie te bereiken.

Voeg voor de lichtgeïnitieerde vrije radicaal-crosslinking de eerder bereide I 2 9 5 9-oplossing toe aan de polymeeroplossing. Voeg dit toe op 10% van het totale gelvolume voor een uiteindelijke initiatorconcentratie van 0,05% gewicht. De cellen en het polymerisatiemengsel zijn nu klaar voor inkapseling in de hydrogel.

Begin met het aspireren van het supernatant uit de gecentrifugeerde cellen. Wacht nadat de eerste aspiratie is voltooid tot de vloeistof is gezakt en aspireer opnieuw om zoveel mogelijk medium te verwijderen zonder het celpellet te verstoren. Resuspendeer het celpellet met de polymeeroplossing om luchtbellen te voorkomen.

Pipetteer de oplossing langzaam ongeveer 10 keer op en neer, wat voldoende moet zijn om de cellen gelijkmatig te verdelen. Gebruik voor de mical-type additiereactie een pipetpunt met een brede opening om het juiste volume crosslinker-oplossing aan de polymeercel toe te voegen. Meng. Stel de pipet in op het gewenste individuele gelvolume.

Pipetteer de oplossing op en neer om deze te homogeniseren en breng deze vervolgens aan in de spuitpuntvormen. Voer deze stap snel uit om een gelijkmatige verdeling van de cellen te waarborgen en laat het mengsel 10 tot 30 minuten incuberen in de cultuurkap voor crosslinking. Voor de lichtgeïnitieerde vrije radicaal-crosslinking.

Verdeel het juiste volume over de spuitpuntvormen. Stel de spuiten bloot aan UV-licht voor radicaalcrosslinking met een blootstelling van 10 minuten bij 365 nanometer. UV-licht van vier milliwatt per vierkante centimeter is gebruikelijk voor ACRL-gefunctionaliseerde polymeren.

Voer deze stap snel uit om bezinking van de cellen vóór blootstelling aan UV-licht te minimaliseren. Dompel de gels na cross-linking in de putjes van een kweekplaat met medium voor incubatie en analyse. Cross-linking van de hydrogel kan ook sequentieel worden uitgevoerd.

Voeg eerst de gefunctionaliseerde kleurstof gemethyleerde rumine toe tot een uiteindelijke concentratie van 20 nanomolar in de gel. De kleurstof helpt bij het visualiseren van het patroon, aangezien deze bij voorkeur wordt ingebouwd in radicaal gecrosslinkte regio's van de gel. Start vervolgens met de polymerisatiereactie van het mic-type die een fractie van de theoretische crosslinks oplevert voor het volgende.

Voor cross-linking via vrije radicalen moet men een masker gebruiken dat is ontworpen in een programma zoals Adobe Photoshop of Illustrator en direct op transparante maskers is geprint. De afmetingen van het masker moeten overeenkomen met de ronde bovenkant van de spuit. Gebruik gesteriliseerde pincetten om een steriel masker direct op het geloppervlak aan te brengen en stel dit bloot aan licht om de gel te cross-linken.

Hieronder worden HMC's getoond binnen HA-gebaseerde hydrogels één uur na encapsulatie. Omdat gesynthetiseerde hydrogels doorgaans transparant zijn, kan de morfologie van de cellen worden gevisualiseerd met lichtmicroscopie. Dezelfde cellen werden 24 uur na encapsulatie gevisualiseerd op viabiliteit met behulp van een fluorescente live-dead kleuringskit.

We gebruikten calcium M om de levende cellen te detecteren en atherium homodimeer voor de dode cellen, waarbij een levensvatbaarheid van meer dan 95% werd waargenomen. We gebruikten daarnaast de alamar blue-assay om het niveau van celproliferatie te bepalen, gemeten aan de hand van de mate waarin de cellen het assay-reagens metaboliseren, wat resulteert in een kleurverandering. De celkleuring werd uitgevoerd op H HMCs zeven dagen na inkapseling in een afbreekbare en adhesieve HA-gebaseerde hydrogel, waarbij standaard fixatie- en permeabilisatieprocedures werden toegepast.

Cellulaire actine is zichtbaar met fluoresceïne-gelabeld phalloïdine en kernen zijn gemarkeerd met DAPI. Immunokleuring tegen culline wordt gebruikt voor de visualisatie van focale adhesies binnen de hydrogelmatrix. Histologische kleuring wordt uitgevoerd na dehydratie, paraffine-inbedding en sectie van de hydrogels volgens standaardprotocollen voor radicaal gepolymeriseerde HA-hydrogels waarin HMSC's zijn ingekapseld.

Na één week in kweek werden deze gekleurd met hematoxyline om de kernen te markeren, ASIN om het bindweefsel te markeren en blauwe kleurstoffen voor glycosaminoglycanen. Realtime PCR wordt gebruikt om de differentiatie van ingekapselde stamcellen te kwantificeren. Na aftrek van de achtergrond wordt het expressieniveau van een gen van belang bepaald aan de hand van het cyclusaantal waarbij de drempelfluorescentie werd bereikt, vergeleken met een passief referentiesignaal, wat een constitutief actief housekeeping-gen is. We hebben u zojuist laten zien hoe u cellen kunt inkapselen in 3D-hydrogels en het gedrag van cellen in gels kunt bestuderen.

Bij het gebruik van deze procedures is het belangrijk om de volledige steriliteit van materialen te waarborgen, hetzij door steriele buffers oplossingen en reagentia langdurig te bewaren, of door te steriliseren met de kiemdodend UV-lamp. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.