Technische Cel-permeabel Protein

De manipulatie van cellulaire functies kon de afgelopen 15 jaar worden bereikt via de klassieke benaderingen van DNA-transfectie of virale transductie. Er is inmiddels een andere methode ontwikkeld. Bij proteïne-transductie kunnen biologisch actieve eiwitten direct in zoogdiercellen worden gebracht met behulp van kleine peptiden die zijn gefuseerd aan het eiwit van belang, wat de cellulaire opname bevordert.

Omdat er geen DNA wordt gebruikt, wordt het risico op insertionele mutagenese voorkomen. In tegenstelling tot de bovengenoemde klassieke methoden maakt proteïne-transductie de levering van eiwitten op een titreerbare manier mogelijk.

Bovendien kunnen kleine celpopulaties en niet-delende cellen, zoals post-mitotische neuronen, worden gemoduleerd. Voor een efficiënte expressie van recombinant eiwit bevelen wij het gebruik van het Paciz-vectorsysteem aan. Dit is een modulair vectorsysteem dat bestaat uit een N-terminale en een C-terminale variant.

Beide vectoren maken een eenvoudige insertie van uw gen van belang mogelijk voor zuiveringsdoeleinden. Er is zowel een histidinetag als een proteinetransductiedomein geïntegreerd. In ons geval een domein van het HI-virus dat de cellulaire opname bevordert voor cellulaire distributie.

Een kernlokalisatiesignaal voltooit de vector; om controle-redenen kunnen fusietags eenvoudig worden verwijderd. Daarnaast kan de rangschikking van deze tags een grote invloed hebben op de eigenschappen van de fusie-eiwitten. De invloed op opbrengst en zuiverheid, evenals op verkoopbaarheid en biologische functie, is niet voorspelbaar.

Hallo, mijn naam is Bernard Mus en ik werk in de groep Stamceltechniek aan het Instituut voor Reconstructieve Neurobiologie in Bonn, Duitsland. Hallo, mijn naam is Christoph P en ik ben ook lid van het Hoover Lab. Onze werkgroep maakt intensief gebruik van de proteinetransductietechniek om biologisch actieve eiwitten direct af te leveren in diverse zoogdiercellen, en vandaag willen we u meenemen door het proces van expressie en zuivering in en uit e coli.

Vervolgens willen we laten zien hoe een celpermanent fusie-eiwit in een celcultuur kan worden toegepast om de volledige procedure van expressie, zuivering en toepassing te illustreren. We maken gebruik van de site-specifieke recombinatie Cre om muis-onic stamcellen genetisch te modificeren. Oké. Oké. Laten we beginnen.

Om de overnight-cultuur te inoculeren, maken we gebruik van reeds getransformeerde bacteriën die bewaard zijn in een glycerolstock bij min 80 graden Celsius. Deze bacteriën bevatten al de vector die codeert voor decre recombinatie. Met een pipetpunt schrapen we een kleine hoeveelheid bacteriën op de punt en laten we deze in het bekerglas met de overnight-cultuur vallen.

De overnight-kweek bestaat uit LB-medium aangevuld met glucose tot een uiteindelijke concentratie van 0,5% en 50 microgram carboninsuline per ml. Het bikaerglas wordt vervolgens in een incubator geplaatst bij 37 °C voor de expressie van de site-specifieke Recombinate Cree. Voor onze grootschalige expressiekweek gebruiken we vooraf verwarmd TB-medium.

Om de expressie te versnellen, raden wij het gebruik aan van TB-medium dat is opgewarmd tot 37 °C, wat de temperatuur is tijdens de expressie van het recombinante eiwit. Vervolgens voegen we glucose toe aan het TB-medium tot een eindconcentratie van 0,5%. De glucose voorkomt een verhoogde basale expressie van het fusie-eiwit tijdens de groei van de expressiecultuur vóór inductie. Ten slotte wordt ampicilline toegevoegd aan de expressiecultuur tot een eindconcentratie van 100 µg/ml om een zuivere cultuur te garanderen die alleen bacteriën bevat die nog steeds het plasmide dragen dat codeert voor het eiwit.

We kunnen nu de overnight-kweek pakken en de expressiekweek inoculeren in een verhouding van 1:50. De bekerglazen worden vervolgens overgebracht naar een incubator die is ingesteld op een temperatuur van 37 °C. Tijdens de expressie dienen er regelmatig monsters te worden genomen om de optische dichtheid te meten.

Zodra de cultuur een optische dichtheid van 1,5 heeft bereikt, worden de bacteriën geïnduceerd met een eindconcentratie van 0,5 millimolar IPTG. Na één uur inductie wordt de expressiecultuur overgebracht naar buisjes en vervolgens geoogst via centrifugatie. Hiervoor gebruiken we een SLA 3000-rotor.

De centrifuge draait op een snelheid van 5.000 rpm gedurende 10 minuten bij 4 °C. Het supernatant wordt vervolgens weggegooid en de bacteriepellet kan onbeperkt worden bewaard bij -20 °C. De bevroren pellets worden geresuspendeerd in Lysis-buffer, een volume dat overeenkomt met één liter expressiecultuur.

We gebruiken 10 ml lizza-buffer en wachten ongeveer 15 minuten tot de oplossing homogeen is. Vervolgens wordt er één milligram lysozym per ml suspensie toegevoegd. De oplossing wordt 20 minuten gemengd om het enzym de kans te geven de bacteriën open te breken.

Vervolgens wordt Benzonase toegevoegd in een verdunning van 1:1000 gedurende nog eens 15 minuten, wat het DNA zal afbreken en resulteert in een niet-viskeuze oplossing. Ten slotte wordt een sonicator gebruikt om de lysis van de cellen te waarborgen. Het programma draait gedurende anderhalf minuut met een vermogen van 45% na voltooiing van de certificering.

Vergeet niet om bij elke stap hier een monster te nemen, het ruwe lysaat of de SDS-PAGE-analyse van de zuivering. Het is nu erg belangrijk om 1 ml ijskoud TSB-buffer per mL suspensie toe te voegen, aangezien het eiwit de neiging zal hebben om neer te slaan in de glycerolstock. Als u deze stap overslaat, wordt de oplossing kort gemengd en is het ruwe lysaat nu klaar voor centrifugatie.

Hiervoor gebruiken we een SS 34-rotor. De centrifuge draait 30 minuten lang bij 17.000 RPM bij vier graden Celsius. Na afloop wordt de supernatant voorzichtig overgebracht naar nieuwe 50 ml Falcon-buisjes.

Voeg nu een slurry van nikkel-anti-A toe aan het supernatant. Anti-A is een cruciaal reagens voor de juiste zuivering van de histidine-getagde fusie-eiwitten. De histidine vormt een complex met de nikkelionen, wat affiniteitszuivering mogelijk maakt. Schud de centrifugebuisjes nu voorzichtig gedurende 60 minuten bij 40 °C.

Na één uur kunt u de suspensie aanbrengen op kolommen van 20 ML en de oplossing door zwaartekrachtstroom laten lopen. Voor grootschalige producties is het mogelijk om de suspensie over meerdere kolommen te verdelen. Vervolgens wassen we de kolom twee keer met een buffer die 15 millimolar innersole bevat.

De hoeveelheid toegepaste buffer is afhankelijk van het harsvolume. Twee mL nikkel-NTA komen overeen met één mL hars voor wasdoeleinden. We brengen vijf harsvolumes wasbuffer aan op de kolom; na het wassen zijn we klaar om ons eiwit te elueren.

Daarom gebruiken we een elutiebuffer met een concentratie van 250 millimolair immuno. Let op hoe de kleur van de hars verandert naar groen. Vanwege de hoge concentraties CRE-eiwit wordt de OID-fractie soms troebel.

Om dit te voorkomen, mengt u de oplossing en voegt u extra lysbuffer toe; alle fracties worden nu samengevoegd en vervolgens overgebracht naar een lysisbuis. Lysis zal de ole verwijderen; de eerste dialysestap wordt uitgevoerd tegen de buffer met een hoge zoutconcentratie. Na één uur wordt de buffer met het hoge zoutgehalte vervangen en wordt de dialyseprocedure gedurende de nacht toegepast.

De volgende dag wordt de dialyseslang uit de buffer met hoog zoutgehalte gehaald en overgebracht naar een glycerolbuffer. Na drie tot vijf uur wordt de glycerolbuffer vervangen en wordt de dialyse opnieuw gedurende de nacht uitgevoerd. Lyse tegen een glycerolbuffer resulteert in een voorraadoplossing die minstens drievoudig geconcentreerd is.

De stamoplossing kan nu gedurende enkele jaren bij -20 °C worden bewaard zonder verlies van activiteit. Voor kwaliteitscontrole kunt u de verzamelde SDS-PAGE-monsters op een gel laden en deze vervolgens kleuren. Voor Kamasi is het Cree-fusie-eiwit detecteerbaar als een prominente band in de OID-fractie. Om de juiste concentratie crew-recombinatie te gebruiken, dient u de concentratie te bepalen via een Redford-assay.

Hoe u permanente eiwitten in zoogdiercellen kunt brengen. Bereid eerst uw doelcellen voor om de hoogste eiwittransductie-efficiënties te bereiken. Zorg ervoor dat monolayercellen op een dichtheid worden gezaaid die de volgende dag resulteert in een celconfluentie van 80 tot 90%, in het geval dat uw doelcellen geen cellen zijn die in compacte kolonies groeien.

Scheid de cellen somatisch en maak vijf uur voorafgaand een enkelcellesuspensie. Het is belangrijk om een enkelcellesuspensie te maken vóór de proteïnetransductie, omdat anders alleen de cellen aan het oppervlak van een kolonie getransduceerd kunnen worden. Aspireer het medium en observeer de cellen kort met PPS vóór de behandeling.

Verwijder het resterende groeimedium dat serum bevat. Na het aspireren van de PPS-overlay, spoel de cellen door en laat ze drie tot vijf minuten incuberen. Controleer nu met de microscoop of alle kolonies zijn opgelost in individuele cellen.

Om de zojuist genoemde redenen is dit een cruciale stap voor proteïne-transductie in gistcellen. Breng de losgekoppelde cellen over naar een buisje. Plaats het buisje in een centrifuge en centrifugeer de cellen tot een pellet, aspireer het supernatant en resuspendeer de cellen.

Verdun de cellen in groeimedium tot het juiste celgetal. Dit hangt uiteraard af van de grootte van de weefselkweekschaal. Incubeer de cellen in de schaal nog vijf uur extra.

Dit geeft de cellen voldoende tijd om zich aan de bodem te hechten en adherent te groeien. Voorraad van drie klassen rijen kan gedurende meer dan twee jaar bij minus 20 graden worden bewaard. Bij het werken met recombinant celpermanent fusie-eiwit is het zeer voordelig om over een dergelijke voorraadoplossing te beschikken die op aanvraag kan worden gebruikt.

Terwijl u wacht tot de cellen aan de schaal hechten, kan men de C-transductiemedia voorbereiden door simpelweg een geschikt volume van de cell-permanent creep-proteïne uit de cholesterolvoorraad te verdunnen in de eigen media. Aangezien de Clare-stockoplossing nog niet steriel is, moet het transductiemedium vóór toepassing steriel gefilterd worden. Wij raden het gebruik aan van een spuit die op een proteïnebindend filter kan worden geschroefd.

De uiteindelijke creek-concentratie is afhankelijk van het celtype of de supplementen in het medium. Zo heeft serum een sterke negatieve invloed op de transductie-efficiëntie. Dit kan worden overwonnen door serumvrije media te gebruiken of door de creek-concentratie te verhogen.

We bepalen de optimale conditie voor de hoogste recombinatie-efficiëntie. Varieer de concentratie van hydraat van 0,5 tot 10 µM. We raden aan om verschillende incubatietijden tussen 6 en 18 uur te testen.

Haal na vijf uur incubatie de doelcellen uit de incubator en aspireer het cross-medium. Vervang dit vervolgens door proteïnetransductiemedium en plaats de cellen voor een nachtelijke incubatie terug in de incubator. Was de cellen kort met PBS en vervang het proteïnetransductiemedium door normaal ES-medium.

48 uur na de incubatie van de cellen kan de permanente expressie van het Cre-gen worden gedetecteerd via XUL. Cellen die zijn gekleurd en een positief bga-fenotype vertonen, zijn succesvol genetisch gemodificeerd door locatie-specifieke recombinatie. Cre-rapportage.

De cellen bevatten het CRE-Lae-construct na pre-mediad recombinatie. Een lock P flank stop-sequentie wordt uitgesneden en een luxe reportergen wordt geactiveerd onder invloed van de team-promotor. Om de recombinatie-efficiëntie in vooraf behandelde reporter-luchtcellen te beoordelen, moeten de cellen gefixeerd worden.

Zuig het medium af en was de cellen tweemaal met PBS; bedek de cellen met 4% PFA en laat de cellen 10 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Was de cellen daarna nogmaals drie keer met PBS. Nadat het PBS uit de laatste wasstap is weggezogen, wordt de Xal Stain-oplossing aan de wells toegevoegd en worden de cellen overnight geïncubeerd bij 37 °C in een incubator.

De volgende dag kan de activiteit van Beal worden gemonitord aan de hand van blauwe gekleurde cellen. De recombinatie-efficiëntie kan worden bepaald door het aantal blauwe koloniën. Onder optimale omstandigheden zou u een recombinatie-efficiëntie van meer dan 90% moeten kunnen bereiken. Vandaag hebben we u laten zien hoe u site-specifieke query-recombinatie uit E. coli kunt tot expressie brengen en zuiveren.

In deze proof-of-principle-studie waren we in staat om recombinatie op te wekken in de meeste zouten. Oké, dat was het. Veel succes met uw experimenten.