Het meten van diffusiecoëfficiënten via twee-foton Fluorescence Recovery After Photobleaching

De procedure voor herstel van multifoton-fluorescentie na fotobleken kan eenvoudig worden gedemonstreerd met een vrij diffunderend monster van fluorescerende kleurstofmoleculen. Eerst wordt een laserstraal met lage intensiteit in het monster gestuurd om een referentieniveau van fluorescentie te genereren vanuit de D-moleculen binnen het brandpuntvolume van de laser.

Vervolgens wordt een korte, hoogintensieve laserflits verzonden om een deel van de kleurstofmoleculen binnen het brandpuntvolume te fotobleken. Ten slotte wordt de laserstraal verzwakt tot het eerdere lage intensiteitsniveau en wordt de fluorescentie gemonitord terwijl de gefotobleekte moleculen naar buiten diffunderen en worden vervangen door nog fluorescerende moleculen van buiten het brandpuntvolume. De resulterende curve van de fluorescentie als functie van de tijd wordt geanalyseerd om de diffusiecoëfficiënt te bepalen.

Hoi, ik ben Kelly Sullivan van het laboratorium van Edward Brown van de afdeling Biomedical Engineering aan de University of Rochester. Vandaag laten we u zien hoe u multi-foton fluorescentieherstel na fotobleken uitvoert. In ons laboratorium gebruiken we deze techniek om diffusie te bestuderen in zowel in vitro als in vivo biologische systemen.

Laten we beginnen. Stel eerst de gewenste golflengte van de laser in en plaats het juiste filter voor de fotomultiplierbuis of PMT. Pas vervolgens het laservermogen aan naar 200 milliwatt of minder om beschadiging van de pcal-cel te voorkomen.

Er zijn twee spiegels geplaatst in een figuur-vier-configuratie stroomopwaarts van de pcal-cel. Deze spiegels zijn noodzakelijk en voldoende om de laserstraal door de pcal-cel uit te lijnen. Stel de spanningsoffset op de bias-controller van de pcal-cel in op nul en pas het laserpad door de pcal-cel aan, zodat de laser gecentreerd is in de voor- en achterruiten.

Gebruik de spiegel stroomopwaarts in de figure-four om de straal in het voorste venster te centreren en de spiegel stroomafwaarts in de figure-four om de straal in het achterste venster te centreren. Stel nu de spanning over het pcal-celkristal in op de maximale waarde. De juiste waarde is afhankelijk van de golflengte en kan worden gevonden in de handleiding van de pcal-cel.

Stel de spiegels in figuur vier stroomopwaarts van de pcal-cel zo af dat het uitgangsvermogen van de pcal-cel wordt gemaximaliseerd. Zet nu de spanning over het kristal op nul en pas de spanningsoffset op de biascontroller aan om het uitgangsvermogen van de pcal-cel te minimaliseren. Breng het op de pcal-cel vallende laservermogen terug naar de voor het experiment vereiste waarde.

Ga nu naar de microscoop en stel de visuele focus goed in op een gestandaardiseerd fluorescent sample. In dit geval gebruiken we gefixeerde fluorescente pollenkorrels. Zodra de focus is ingesteld, sluit u de microscoop af en past u het laservermogen aan naar een geschikt niveau voor het afbeelden van het sample door de spanning over het pcal-celkristal te wijzigen.

Schakel tenslotte de lichten uit en zet de PMT aan. Start een herhaalde beeldscan van het gestandaardiseerde monster en stel de spiegels stroomafwaarts van de pcal-cel af totdat er een scherp beeld van het monster wordt verkregen. Laten we nu kijken naar het bepalen van veilige monitorvermogens voor de focus binnen het monster.

Voor deze video gebruiken we een monster van een waterige kleurstof in een inkeping van een glazen objectglas, afgedekt met een dekglas. Stel de laser in op een laag maar adequaat vermogen om fluorescentie in het monster op te wekken. Sluit de microscoop af en leid de output van de PMT naar de fotonteller.

Schakel de verlichting uit, zet de PMT aan en start een point scan in de microscoopsoftware. Stel de fotonenteller zo in dat de integratie plaatsvindt over een tijdschaal die veel langer is dan de verwachte fluorescentiehersteltijd en registreer een representatief aantal datapunten. Verhoog het vermogen en neem een volgende reeks fotonentellingsgegevens op.

Verhoog het vermogen verder totdat de toename in fotonenaantallen significant lijkt af te nemen. Met betrekking tot de grafiek van de vermogenstoename: de logaritme van de fotonenaantallen als functie van de logaritme van het vermogen. Elke afwijking van een helling van twee duidt op bleken.

Select tijdens het monitoren een redelijk monitorvermogen dat onder deze afkapwaarde ligt. Laten we nu de invoerparameters voor de multichannel scaler en de pulsgenerator bepalen. Op de pulsgenerator.

Stel de pre-teach tijd in op één tot twee keer de verwachte halve hersteltijd en de bleach-tijd op één tiende van de verwachte halve hersteltijd op de scaler. Stel de bin-breedte in op ongeveer de helft van de bleach-duur en bepaal het aantal bins per record, zodanig dat het product van de geselecteerde bin-breedte en het aantal bins per record groter is dan de verwachte volledige hersteltijd. Tel de preble- en bleach-tijden erbij op, ga terug naar de pulsgenerator en stel de frequentie van de preble- en bleach-sequentie in op een waarde die net kleiner is dan de inverse van het product van de bin-breedte vermenigvuldigd met het aantal bins per record.

Stel tot slot het aantal records per scan op de scaler in op basis van de signaalintensiteit bij het gekozen monitorvermogen. Stel nu het monitorvermogen in op een veilig niveau en stel het bleach-vermogen in op ongeveer 200 milliwatt boven de bleaching-cutoff die tijdens de monitor-bleachingtest is vastgesteld. Beide vermogens worden ingesteld als verschillende spanningen over de kristalafdichting van de al-cel; schakel vervolgens de lichten van de microscoop uit.

Zet de PMT aan. Start een puntscan in de imaging-software. Start vervolgens de pulsgenerator en de scaler.

Markeer drie belangrijke punten om de resulterende herstelcurve te analyseren: de fluorescentie vóór het bleken, de fluorescentie direct na het bleken en de fluorescentie aan het einde van de dataset. Gebruik de fluorescentiewaarden vóór en direct na het bleken om de halve hersteltijd nauwkeuriger te schatten.

Gebruik nu de in eerdere stappen beschreven regels om de waarden voor de prebleach bleach en de beginbreedteduur te actualiseren. Neem een nieuwe curve en blijf de parameters aanpassen totdat de resulterende curve een sterke bleach en een vloeiend herstel vertoont. Controleer op excitatieverzadiging door de logaritme van de bleach-diepteparameter uit te zetten als functie van de logaritme van het vermogen.

Elke afwijking van een helling van twee duidt op excitatieverzadiging. Kies een bleekvermogen dat een sterke bleking oplevert zonder verzadiging te veroorzaken. Ga tenslotte, nadat de juiste parameters zijn bepaald, verder met het maken van multi-foton fluorescentieherstel na fotobleken of MP FP-curves van uw betreffende monster.

Nu tonen we representatieve resultaten van zowel de ruwe MP FRAP-gegevens als een genormaliseerde MP FRAP-curve die is gefit om de diffusiecoëfficiënt te bepalen. De ruwe MP FRAP-gegevens vertonen een sterke bleaching en een geleidelijk herstel. Voor het fitten van de gegevens wordt het volledige herstel gerapporteerd voor de tweede helft van de data. We normaliseren eerst het herstel ten opzichte van de gemiddelde pre-bleach fluorescentie en voeren vervolgens een non-lineaire kleinste-kwadratenfit uit.

Met betrekking tot het toepaselijke model. Beide datasets zijn opgenomen in waterige fluoresceïne en leveren diffusiecoëfficiënten op. In overeenstemming met de literatuur hebben we u zojuist laten zien hoe u een multiphoton fluorescence recovery after photobleaching-experiment uitvoert.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om zorgvuldig te zijn bij het instellen van uw experimentele parameters, in het bijzonder de bleach-duur en de bleaching- en monitoring-vermogens, binnen de veilige limieten zoals gedefinieerd in het protocol. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.