Live-dissectie van Drosophila Embryo's: Gestroomlijnde methoden voor het screenen Mutant Collections door antilichaam kleuring

Hier zien we de procedure voor het verzamelen van embryo's. Breng de vliegen over van de vials naar de buizen van een verzamelkamer met vijf compartimenten. Plaats vervolgens een grape agri plate bovenop de kamer en laat de vliegen gedurende enkele uren eieren leggen.

Wanneer de embryo's het juiste stadium hebben bereikt, brengt u ze met een penseel over van de grape aate naar dubbelzijdige plakband. Rol de embryo's nu uit hun kons en lijn ze met hun ventrale zijde op een agarblok uit. In het midden zien we een objectglas met een rechthoek van was en een stuk dubbelzijdige plakband. Keer aan één uiteinde de dubbelzijdige plakband over het blok met de uitgelijnde embryo's en raak de embryo's aan om ze over te brengen naar het objectglas.

Ze zullen nu onmiddellijk met de dorsale zijde naar boven liggen. Voeg PBS toe aan het gebied van het objectglas dat is omsloten door de wasrechthoek, zodat de embryo's bedekt zijn. Boven wordt een zijaanzicht van het objectglas getoond en onder een bovenaanzicht.

Maak met een glazen dissectienaald een snede langs het vliesmembraan. Prik in het hersengebied van de embryo's, til ze op en plaats ze in rijen op het glas. Dissekeer vervolgens elk embryo om een filet te maken.

Aan het einde van de procedure beschikt u over een objectglas met rijen embryo's van de filet. Deze kunnen nu worden gefixeerd. Hallo, ik ben Peter Lee, postdoctoraal onderzoeker in het Kaizen-lab van de afdeling biologie aan Caltech.

Hoi, ik ben Ashley Wright, een promovendus aan Caltech in het lab van Kaizen. Ik ben Kaizen, professor aan Caltech, en mijn onderzoeksgroep houdt zich bezig met de ontwikkeling van het zenuwstelsel bij fruitvliegen. Vandaag laten we u een procedure zien voor het dissecteren van levende opal-embryo's.

We hebben deze methoden gebruikt om te zoeken naar liganden voor weesreceptoren. Dit doen we door collecties lijnen die celoppervlakte-eiwitten overexpresseren te screenen middels levende kleuring van embryo's met receptorfusie-eiwitten. We gebruiken deze procedure in het laboratorium ook om embryonale fenotypen te bestuderen en genetische screens uit te voeren.

Ik heb een tekort-screening uitgevoerd voor motorische handelingen op basis van fenotypes van de geleiding. Laten we beginnen. Peter gaat laten zien hoe dit wordt gedaan.

Begin met het aanbrengen van een stip gistpasta met een spatel op een grape agri egg collection plate, overeenkomend met elk van de vaten van een embryo-verzamelkamer. Spuit vervolgens koolstofdioxidegas in de vliegflacons om de vliegen te narcotiseren. Draag een paar honderd vliegen direct over naar de verzamelkamer.

Dek vervolgens de kamer af met de plaat voor eiercollectie en druk deze aan. Bevestig de kamer en de plaat aan elkaar met een 20 inch lange strip labeltape, beginnend vanuit het midden van de agaplaat. De tape zal overlappen op de plaat voor eiercollectie. Nadat de vliegen zijn ontwaakt, worden ze twee of drie uur in een horizontale positie in het donker bij kamertemperatuur geïncubeerd. Tik na de incubatie de vliegen naar beneden en vervang de collectieplaat.

Indien er minder dan 100 embryo's aanwezig zijn op elke sector van de verwijderde plaat, dient men door te gaan met het verzamelen in intervallen van twee uur totdat er voldoende embryo's zijn verzameld. De verzamelde embryo's kunnen worden samengevoegd volgens de specificaties in het bijbehorende schriftelijke protocol.

Om de embryo's te laten ouder worden, plaatst u een nat stuk filterpapier van 90 millimeter in het deksel van een Petrischaal en plaatst u de opvangplaat met de embryo's ondersteboven erop. Incubeer de plaat gedurende de gewenste tijd en bij de gewenste temperatuur. Bereid een objectglas voor het bepalen van het stadium en het sorteren van de embryo's door dubbelzijdige plakband op een objectglas aan te brengen. Plaats vervolgens een rechthoekig blok druivenagar op het objectglas.

De egger moet groot genoeg zijn om vijf tot 10 rijen van 10 tot 15 embryo's te bevatten. Zodra de embryo's het gewenste stadium hebben bereikt, worden ze uit de incubator gehaald. Breng de verouderde embryo's over van de verzamelplaat naar de dubbelzijdige plakband.

Spreid de embryo's gelijkmatig over de tape met een natte penseel. Bekijk de SOAR-embryo's onder een GFP-dissectiemicroscoop om de juiste GFP-expressie vast te stellen, wat het genotype aangeeft. In dit experiment wordt de genotypering uitgevoerd door embryo's te selecteren die geen expressie vertonen van de balancer curly arm, GFP.

Aangezien de genotypering van embryo's zal variëren afhankelijk van de gebruikte balancer, raadpleegt u voor meer informatie over het uitvoeren hiervan het bijbehorende geschreven protocol. Stap. Gebruik vervolgens een stompe dissectienaald om de embryo's te coaten door ze voorzichtig over de dubbelzijdige plakband te rollen. In stadium 16 is de darm verdeeld in drie banden.

Daarna begint de darm zich te ontwikkelen met diagonale banden nabij de staart, waarna deze zich oprolt en het embryo duidelijker zichtbaar wordt. Gebruik vervolgens de dissectienaald om elk embryo over het chorion of andere embryo's heen te rollen. Til het embryo op zonder de tape aan te raken en breng het over naar de plaat met druivenagar.

Lijn de gecoate embryo's op deze plaat uit zodat hun dorsale zijde tegen de agarplaat rust en de posterieure uiteinden naar beneden wijzen. Plaats vervolgens het objectglas in een Petrischaal met nat filterpapier en incubeer de embryo's bij kamertemperatuur tot ze de gewenste leeftijd hebben bereikt. Bereid voor de dissectie een objectglas voor live dissectie voor door een klein rechthoekig stukje dubbelzijdige plakband af te snijden. Plaats de tape met een waspen nabij één uiteinde van een super frost plus objectglas.

Teken een rechthoek rondom de tape met een breedte ter grootte van het objectglas en een lengte van 30 tot 40 millimeter. Er moet ongeveer drie millimeter ruimte zijn tussen de was en de tape. Breng vervolgens de embryo's van de plaat over naar de tape door het objectglas om te keren en het voorzichtig op de uitgelijnde embryo's te laten zakken, zodat de tape met hen in contact komt.

De embryo's moeten zo georiënteerd worden dat de posterieure uiteinden naar beneden wijzen. Na de overdracht zullen de embryo's met de dorsale zijde naar boven op het objectglas liggen; voeg onmiddellijk XPBS toe over de embryo's om de waxen rechthoek te vullen met behulp van een glazen dissectienaald, die met een naaldtrekker is gemaakt zoals een injectienaald. Snijd langs de dorsale middellijn, beginnend bij het posterieure uiteinde van het embryo.

Prik nu in het anterieure uiteinde van het embryo en til het op. Begin onderaan en verplaats het embryo naar de rechterkant van de tapestrip, terwijl u het in de buffer houdt. Ga door met het dissekeren en verplaatsen van embryo's, zodat er op het preparaat een geordende rij embryo's ontstaat die overeenkomt met elke rij op de agri slab.

Duw met de ontleednaald de flappen van de lichaamswand voorzichtig plat op het objectglas, zonder het materiaal op het oppervlak uit te rekken of te verwijderen. De naald mag alleen contact maken met de anterieure en posterieure hoeken aan de dorsale randen van de lichaamswand.

Aangezien motorische axonen niet zo ver reiken. Vermijd dorsaal het raken van de naalden van het objectglas, omdat dit zal breken nadat alle embryo's zijn overgebracht en op het objectglas zijn bevestigd. Verwijder de darm uit elk embryo door de vier darmen bij het hersengebied door te snijden en de gehele darm weg te trekken van het embryo.

Verplaats de achterdarm naar het objectglas. Zodra alle dissecties zijn voltooid, gebruikt u twee pasteurenpipetten om gelijktijdig formaldehyde van 5% op kamertemperatuur in één hoek van de wasrechthoek aan te brengen en de oplossing uit de tegenovergestelde hoek te verwijderen. Vervang de fixeeroplossing drie keer met een totaal volume van ongeveer zes milliliters.

Incubeer de embryo's gedurende 45 minuten in de fixeersolution. Het is zeer belangrijk dat de meniscus de embryo's niet raakt, omdat dit ze zal beschadigen. Gebruik een pasteurenpipet om het grootste deel van de fixeersolution te verwijderen.

Was drie keer met PBS met behulp van de methode met twee Pasteur-pipetten. Was vervolgens drie keer met PBT om de embryo's te permeabiliseren. Deze stap maakt de embryo's daarnaast minder gevoelig voor de meniscus.

Verwijder na de laatste wasbeurt voorzichtig de PBT door de slide te kantelen en dep kort met een Kim wipe op de hoek van het door was omkaderde gebied om overtollige oplossing te verwijderen. Voeg onmiddellijk met een vooraf gevulde micropipet 200 µL blokkeringsoplossing toe en laat dit 10 tot 30 minuten inwerken. Verwijder de blokkeringsoplossing bij kamertemperatuur met een Kim wipe.

Voeg vervolgens onmiddellijk 200 µL van het gewenste primaire antilichaam toe, verdund in blokkeringsoplossing. Plaats de slide in een bevochtigde plaat en incubeer deze gedurende de nacht bij 4 °C. In dit experiment wordt het monoklonale antilichaam 1D4 gebruikt om motorische axonen te labelen.

Verwijder de volgende dag de schaaltjes uit de koelkast op 4 °C en was de embryo's drie keer met PBT op een schudplatform, gedurende ten minste 15 minuten per wasbeurt. Zorg bij alle wasstappen voor voldoende PBT om het objectglas tijdens het schudden volledig onder te dompelen. Blokkeer het objectglas na het wassen van de embryo's op dezelfde wijze als eerder.

Voeg na het blokkeren onmiddellijk 200 µL secundair antilichaam en blokkeeroplossing toe en incubeer twee uur bij kamertemperatuur; hier wordt een Alexa 488 goat anti-US secundair antilichaam gebruikt in combinatie met Rodine Phin om spiervezels te labelen. Was vervolgens drie keer met PBT op het schudplateau gedurende ten minste 15 minuten per wasbeurt.

Verplaats de objectglazen naar een andere bak om detergentresten te verwijderen. Was ze vervolgens twee keer gedurende vijf minuten met PBS. Haal het objectglas uit de PBS, verwijder het grootste deel van de resterende PBS uit de put met een chem wipe en voeg onmiddellijk 500 microliters 70% glycerol toe.

Aangezien glycerol dezelfde brekingsindex heeft als het embryo, zal het uitvoeren van deze stap de kleuring beter zichtbaar maken; maak de embryo's twee uur lang bij kamertemperatuur of overnacht bij vier graden Celsius helder. Verwijder vervolgens de glycerol met een Kimwipe. Het verwijderen van bijna alle glycerol zal de embryo's afplatten, terwijl het verwijderen van minder glycerol zal resulteren in een meer driedimensionale structuur.

Zodra het glycerol is verwijderd, wordt er een dekglas nummer één op geplaatst. De embryo's zijn klaar voor beeldvorming; gedissecteerde en gekleurde embryo's kunnen worden gevisualiseerd met immunofluorescentiemicroscopie. Hier is een gedissecteerd embryo gekleurd met het motor-axon-labelingsantilichaam 1D4.

Deze afbeelding vertoont een gelijkaardig uiterlijk als de vaker voorkomende beelden waarbij HRP-immunohistochemie is gebruikt voor visualisatie via immunofluorescentie. Het is mogelijk om beelden van hogere kwaliteit te verkrijgen waarin de details van de motorische axonvertakkingen duidelijker zichtbaar zijn. Co-kleuring met rhodamine-gelabeld phalloidine, dat bindt aan actine, maakt gelijktijdige visualisatie van de spieren mogelijk.

Dit geeft een duidelijker beeld van de spierlaagvorming en organisatie dan met HRP-kleuring kan worden verkregen. Hier zijn de motorische axonen van de 1D4-neuron in het groen weergegeven en de spieren in het rood. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe levende drosophila-embryo's kunnen worden gedisseceerd uit collecties van mutante lijnen. Bij het uitvoeren van deze procedures is het belangrijk om te beginnen met eenvoudige lijnen, zoals lio, armadillo, GFP-gebalanceerde stammen, en slechts enkele lijnen tegelijk te verwerken.

Naarmate u meer ervaring opdoet en sneller wordt in de dissecties, kunt u tot 10 lijnen per dag verwerken, waardoor u een collectie van ongeveer 200 mutantlijnen in een periode van circa 20 dagen kunt screenen. Dit is dus een zeer efficiënte procedure zodra u bedreven bent in het uitvoeren van alle stappen. Dat was alles; bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.