Het visualiseren van RNA Lokalisatie in Xenopus Eicellen

In deze procedure worden fluorescent gelabelde RNA-transcripten geïnjecteerd in XUS-oocyten en wordt hun lokalisatie gemonitord. Eerst wordt het RNA gelabeld met fluorescente nucleotiden.

In een in vitro transcriptie-reactie wordt het RNA vervolgens geladen in een microinjectieapparaat. De oocyten worden op een injectieschaal geplaatst en zorgvuldig gemicroïnjekteerd. Ten slotte worden de oocyten gekweekt om RNA-lokalisatie mogelijk te maken voordat ze met de confocale microscoop worden afgebeeld.

Hallo, ik ben James Gagnan van het laboratorium van Dr. Kimberly Mallory van de afdeling moleculaire biologie, celbiologie en biochemie aan de Brown University. Vandaag gaan we u een procedure laten zien voor het visualiseren van subcellulaire RNA-lokalisatie in Xap-oocyten. In ons laboratorium gebruiken we deze procedure om de RNA-architectuur en eiwitfactoren te bestuderen die nodig zijn voor RNA-lokalisatie tijdens de vroege ontwikkeling van gewervelde dieren.

Laten we beginnen. Om deze procedure te starten, transcribeert u mRNA dat zowel radioactief als fluorescent is gelabeld, zoals beschreven in het bijbehorende schriftelijke protocol. Voeg DS toe om het template-DNA af te breken en stop vervolgens de reactie door EDTA toe te voegen.

Verwijder niet-ingebouwde nucleotiden en andere kleine moleculen door te centrifugeren door een G 50-kolom. Het RNA wordt vervolgens geconcentreerd door ethanolprecipitatie, gewassen en opnieuw opgelost. Nadat de concentratie door middel van scintillatiemeting is bepaald, wordt het RNA verdund tot 50 nM en bewaard in aliquots van 5 µL bij -80 °C.

Wanneer u klaar bent om de microinjectie uit te voeren, ontdooi dan een aliquot van het gelabelde RNA en denatureer dit bij 70 °C gedurende vijf minuten. Centrifugeer vervolgens 10 minuten op maximale snelheid in een microcentrifuge bij kamertemperatuur om partikels te verwijderen en bewaar het op ijs. Isoleer daarna de oocyten door stukjes eierstok van Xenopus laevis te plaatsen in een conische buis van 50 mL die 25 mL van 3 mg/mL bevat.

Collagenase in een 0,1 molaire kaliumfosfaatbuffer bij pH 7,4. Voorzichtig schudden bij 18 °C vanwege variaties tussen batches. De behandeltijd met collagenase kan variëren en moet zorgvuldig worden bewaakt via visuele inspectie.

Om defoliatie te garanderen, dient men 15 minuten door te schudden of totdat de oocyten zichtbaar van de eierstok zijn gescheiden; laat de oocyten vervolgens naar de bodem van de conische buis zakken. Verwijder de oplossing en vervang deze door MBSH-buffer. Herhaal dit en was nog tweemaal, voor een totaal van drie wasbeurten.

Sorteer vervolgens handmatig de cytes in stadium drie tot vier en de MBSH-buffer onder een standaard lichtmicroscoop. Cytes in stadium drie zijn volledig opaak, maar wit. Cytes in stadium vier zijn iets groter en gespikkeld met pigment.

Cellen die enigszins transparant zijn, zijn te jong en cellen die volledig gepigmenteerd zijn of een gepolariseerde pigmentverdeling vertonen, zijn te oud. Bereid tenslotte de naalden voor de microinjectie voor met capillairen van drie en een half inch, die worden uitgetrokken en afgeschuind om naalden te maken met een buitendiameter van ongeveer 0,05 millimeter. Nu de mRNA, oocyten en naalden gereed zijn, kan worden overgegaan tot de microinjectie.

Begin met het kalibreren van de naald met gedestilleerd water om twee nanoliter per injectie toe te dienen. Laad de naald met een gasgestuurde micro-injector en kalibreer de druppelgrootte met een micrometer; laad na kalibratie het te injecteren RNA in de naald. Plaats vervolgens de gesorteerde oocyten op een injectieschaal in MBSH-buffer; de schaal bevat een laag zwart schuimrubber.

De witte oocyten steken goed af tegen een zwarte achtergrond. Injecteer vervolgens elke oocyt zorgvuldig met twee liters RNA bij 50 nanomolar. Zorg ervoor dat elke oocyte slechts één keer wordt geïnjecteerd en controleer de naald regelmatig op verstoppingen wanneer de injectie is voltooid.

Verwijder het resterende RNA, spoel de naald met gedestilleerd water en vul de volgende RNA-voorraad voor injectie. Breng de geïnjecteerde oocyten na de injectie over naar een well van een steriele 24-wells plaat; er kunnen tot duizend oocyten per well worden gekweekt.

Verwijder de buffer en vervang deze door 400 microliters cyte kweekmedium per well. Plaats de kweekplaat vervolgens in een plastic bak met een natte papieren handdoek om een vochtige omgeving tijdens de kweek te behouden; incubeer de oocyten bij 18 degrees Celsius voor tijdstippen variërend tussen acht en 48 uur na de gewenste incubatieperiode. De oocyten kunnen na incubatie van de geïnjecteerde oocyten worden klaargemaakt voor microscopie.

Verwijder alle dode oocyten en plaats de overlevende oocyten in glazen vials. Een overleving van meer dan 90% van de oocyten wordt routinematig waargenomen. Vervang de buffer door M-E-M-F-A fixeerder en schud de cellen 20 minuten lang.

Bescherm de oocyten tegen zonlicht tijdens de fixatie nadat de fixatieperiode is voltooid. Was de oocyten door het fixatiemiddel te verwijderen en te vervangen door een gelijk volume MBSH-buffer. Herhaal deze wasstap nogmaals, voor in totaal twee wasbeurten.

Was de oocyten vervolgens in watervrij methanol. Verwijder eerst de helft van het volume en vervang dit door methanol. Herhaal dit nog twee keer.

Verwijder na deze wasbeurten alle vloeistof en vervang deze door methanol. Herhaal deze methanol-wasbeurt nogmaals. De gefixeerde en gedehydrateerde oocyten kunnen bij -20 °C worden bewaard tot ze klaar zijn voor beeldvorming.

Voeg vóór de beeldvorming Marie's clearing medium toe aan een glazen WPI-fluoroschaaltje om het beeldvormingsoppervlak te bedekken. Breng de oocyten voorzichtig over van methanol naar het fluoroschaaltje, waarbij het volume overgedragen methanol tot een minimum wordt beperkt om de oocyten af te beelden op een omgekeerde confocale microscoop; zowel een Zeiss LSM 510 als een Leica TCS SP geven goede resultaten. We tonen nu enkele representatieve beelden van subcellulaire RNA-lokalisatie direct na micro-injectie; fluorescent RNA is zichtbaar in de nucleus na acht uur cultuur van de fluorescent gelabelde controle.

RNA kan uniform verdeeld worden waargenomen in het cytoplasma van de oocyten. Echter, een fluorescentie-gelabeld RNA dat sequenties bevat die het transportmechanisme rekruteren, kan worden waargenomen tijdens het proces van subcellulaire lokalisatie naar de vegetatieve pool van de oocyt. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe fluorescentie-gelabelde RNA's in oocyten kunnen worden gemicro-injecteerd en hoe de RNA-lokalisatie via confocale microscopie kan worden geobserveerd.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om DEPC-behandelde oplossingen te gebruiken om RNA-contaminatie te voorkomen, de oocyten te kweken in OCM met antibiotica en de oocyten zoveel mogelijk te beschermen tegen zonlicht om fotobleken te voorkomen. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.