Robotica en Dynamic Image Analysis voor Studies van genexpressie in plantenweefsels

In deze procedure wordt de dynamiek van genexpressie in plantenweefsels over tijd in beeld gebracht met behulp van robotica; eerst worden limobonen zaden gesteriliseerd en voor kieming tussen vochtige papieren handdoeken in een weefselkweekcontainer geplaatst. Na vier dagen worden de cotylodonen verwijderd en gebombardeerd met een DNA-construct bestaande uit een promotor gefuseerd aan GFP. De in Petri-schalen geplaatste cotylodonen worden gemonteerd op een op maat ontworpen tweedimensionaal robotisch systeem voor beeldverzameling. De robot is geprogrammeerd om elke uur gedurende 100 uur beelden van elk weefselstuk vast te leggen.

Afbeeldingen worden onderworpen aan beeldanalyse, wat kwantitatieve gegevens oplevert over de intensiteit van de GFP-expressie in de loop van de tijd. Hallo, ik ben John Finer, directeur van het Plant Transformation Laboratory van de afdeling Horticulture and Crop Science aan de Ohio State University. Ik ben Carlos Herandez Garcia, PhD-student in het laboratorium van de Ohio State University.

Vandaag zal Carlos het protocol laten zien dat we hebben ontwikkeld voor de analyse van genexpressie in plantenweefsels met behulp van het groen fluorescerende eiwit. We gebruiken deze in het laboratorium ontwikkelde procedure om de activiteit van de OD-stam te meten. Hiervoor hebben we de promoter stroomopwaarts van het GFP-gen geplaatst, dat fungeert als ons reportergen.

Ik zal u laten zien hoe we promotercontrole introduceren in de stengelvaten van de liaupoon en hoe we een toepassing uitvoeren op ons op maat gemaakte robotische systeem voor beeldvastlegging. Ik zal afsluiten met een bespreking van ons protocol voor beeldanalyse. Laten we beginnen. Voor deze procedure worden liaupoonzaden oppervlakte-gesteriliseerd volgens standaardprocedures.

Plaats de gesteriliseerde zaden in magenta GA zeven-containers tussen lagen vochtige papieren handdoeken en incubeer ze gedurende vier dagen bij 25 °C. Hier gebruiken we een expressievector met een hoog kopieaantal, die nuttig is voor analyses van promoters en promoterelementen. Deze vector bevat het GFP-gen, dat wordt gebruikt om de functie van de promoter of het promoterelement in getransformeerde weefsels te visualiseren, ongeveer één tot twee uur voor de bombardement.

Snijd de CU-leidingen van de zaadhulzen van de tuinbon uit. CU-leidingen die geschikt zijn voor bombardement moeten geel tot lichtgroen zijn, plat zijn en direct na uitname vrij zijn van enige beschadiging die verdere beeldanalyse kan beïnvloeden; plaats 12 CU-leidingen in een Petrischaal met OMS-kweekmedium dat MS-zouten B, vijf vitaminen, 3% sucrose en 0,2% gelrate bevat bij een pH van 5,7. Precipiteer vervolgens het DNA-construct op M 10 wolfraamdeeltjes. Resuspendeer de deeltjes vlak voor gebruik eerst in steriel water tot een concentratie van 100 milligram per milliliter.

Voeg vervolgens in een centrifugeerbuisje van 0,6 milliliter 25 µL partikels, 5 µL DNA met een concentratie van 1 µg/µL, 25 µL 2,5 M calciumchloride en 10 µL 100 mM spermine toe. Incubeer de DNA-preparatie vijf minuten op ijs, verwijder daarna 50 µL van de oplossing boven de partikels en gooi deze weg. Resuspendeer de met DNA gecoate partikels die onderin de buis zijn gebleven door middel van vortexen.

Verwijder direct na het vortexen twee µL Eloqua. Herhaal deze vortexstap. Telkens wanneer Eloqua wordt verwijderd, moeten de gecoate deeltjes op ijs worden bewaard en binnen 15 minuten worden gebruikt.

Nu het DNA op de deeltjes is gecoat, brengt u twee µL deeltjes aan via de bovenkant van een spuitfilter in het midden van een filterscherm. Plaats vervolgens de spuitfilter in de filterhouder binnen de particle inflow gun of PIG-kamer. Plaats een lima bean co leadin met de axiale zijde naar boven op een baffle, bestaande uit een scherm dat aan de bodem van een bekerglas is gesmolten.

Plaats het schot, dat dient als platform om weefsels te ondersteunen tijdens het bombardement in de kamer van het partikelkanon. Om het weefsel te bombarderen, wordt eerst de klep naar het vacuüm geopend om de kamer te evacueren. Wanneer het vacuüm 760 millimeters kwik bereikt, wordt de magneetspoel geactiveerd en het helium vrijgegeven om de partikels voort te stuwen.

De heliumdruk die wordt gebruikt om de deeltjes te versnellen, bedraagt 50 tot 60 PSI. Sluit na de bestraling de vacuümleidingkraan en laat het vacuüm ontsnappen via de afvoerkraan. Wanneer het vacuüm is opgeheven, open dan de kamerdeur om de bestraalde co leadin te verwijderen en plaats de co leadin terug aan de dal-zijde.

Gebruik OMS-kweekmedium voor kwantificering en expressieprofilering. Bombardeer minimaal drie co-leden voor elk DNA-construct. Er is ook een positieve controle opgenomen, die een goed bestudeerd genexpressieprofiel geeft.

De co-leads zijn nu klaar voor beeldvorming. Zet de kwiklamp aan en wacht 30 minuten tot de lamp is opgewarmd. Schakel de stroombronnen in voor de SPOT R-T-C-C-D camera en de motorcontroller, die de beweging aanstuurt van het op maat ontworpen robotplatform waarin acht platen zijn geplaatst.

Stel de filterset voor GFP-detectie in door de GFP-twee filterset te selecteren bij 480 nanometer excitatie en 510 nanometer emissie op een MZ L drie dissectiemicroscoop. Steriliseer vervolgens de verdikte polycarbonaat petrischaaldeksels door ze te besproeien met 70% ethanol. De gespecialiseerde deksels die worden gebruikt om de bodem van de petrischaal af te dekken, voorkomen condensatie tijdens het vastleggen van beelden.

Plaats de platen met de gebombardeerde cuan op het robotplatform en draai de zijdelingse stelschroef aan om ze op hun plaats te fixeren. Open nu de aangepaste softwareapplicatie die zowel het robotplatform als de beeldacquisitie aanstuurt. Schakel via de software ook de schakelaar voor de witte lichtcontroller in en oriënteer het platform naar de home-positie.

Dit wordt uitgevoerd voordat de posities worden ingevoerd. Selecteer voor elke coddle-instelling in het motortabblad de eerste plaat. Het platform positioneert het midden van de Petrischaal onder het objectief van de microscoop.

Positioneer de eerste CU LEADIN nauwkeurig voor beeldcollectie met behulp van de knoppen voor verplaatsingsafstand. Verplaats de cuddle leaden naar het juiste gezichtsveld via de live-modusfunctie. Gebruik voor de eerste cuddle leaden de handmatige knoppen op de dissectiemicroscoop om de focus in te stellen en zet de vergroting op 1.6 x. Zodra het interessegebied is bepaald, klikt u op de knop om deze positie toe te voegen.

De software voegt de coördinaten van dit gebied toe aan een bestand met het positieschema en het platform keert terug naar de centrumposities van de plaat voor alle overige coens op de platen. Gebruik de knoppen voor de verplaatsingsafstand en de drie handmatige nivelleringsschroeven onder elke plaat op het robotplatform om de focus voor de overige coan op dezelfde plaat aan te passen. Zodra alle coördinaten van alle coan zijn ingevoerd, dient u de coördinaten van het positieschema op te slaan.

Voer de parameters voor de beeldcollectie in, zoals het type licht (blauw voor GFP) en de belichtingsinstelling, en specificeer waar de beelden moeten worden opgeslagen, zoals beschreven in het bijbehorende geschreven protocol. Ga naar het tabblad voor de tijdregeling van de acquisitie en stel het tijdsinterval voor de beeldacquisitie en het totale aantal cycli van de beeldcollectie in. Beelden worden doorgaans elke uur gedurende 100 uur verzameld.

Het genereren van goed gedefinieerde genexpressieprofielen. Start de beeldacquisitie door het tabblad met het positieschema te openen en vervolgens op de knop 'run schedule' te klikken. Isoleer het beeldcollectiesysteem van extern licht aan het einde van de 100 uur durende beeldcollectie.

De beelden met hoge resolutie van ongeveer vijf megabyte per stuk zijn klaar voor beeldanalyse. Gebruik ImageReady om de 100 opeenvolgende beelden uit elke map samen te voegen. Importeer alle opeenvolgende beelden als frames en schaal ze naar 800 bij 600 pixels om de beeldbewerking te versnellen.

Gebruik vervolgens markeringen op een nieuw geïntroduceerde laag, die in alle frames zichtbaar is en gebruikmaakt van geselecteerde GFP-spots in de referentieafbeelding. Lijn elke afbeelding handmatig uit; wanneer de uitlijning voltooid is, verwijdert u de laag die als referentie is gebruikt en slaat u het bestand op als één enkel PSD-bestand. Exporteer daarnaast alle frames als één enkel MOV-bestand met de hoogste resolutie.

De bestanden zijn nu gereed om te beginnen met de GFP-kwantificering. Gebruik ImageJ om het MOV-bestand te openen en snijd een gebied van 400 bij 300 pixels uit. Scheid vervolgens de opeenvolgende beelden in rode, blauwe en groene kanalen met behulp van de RGB-splittool voor de rode en groene kanalen.

Trek de achtergrondfluorescentie af met behulp van de 'subtract measured ROI for each slice' plugin-tool. Bereken de GFP-expressie door de drempelwaarden aan te passen en een plugin te gebruiken die is ontworpen om de gemiddelde grijswaarde per pixel en het totale aantal GFP-exprimerende pixels te meten. Kopieer de outputwaarden in ImageJ. Plak tot slot de outputwaarden voor de groene en rode kanalen in Microsoft Office.

Excel voor verdere datamanipulatie om een beeld te geven van de resultaten van de beelduitlijning. Deze eerste animatie toont de onnauwkeurigheid van de herpositionering van het robotplatform tijdens het experiment van 100 uur. De beweging van de stip is een artefact als gevolg van het onvermogen van het robotplatform om na handmatige beelduitlijning op elk tijdstip naar exact dezelfde positie terug te keren; de GFP-expresserende cellen kunnen gemakkelijk worden waargenomen en de unieke kenmerken van dit trackingsysteem zijn eenvoudig te visualiseren.

Terwijl deze animatie zich herhaalt, let op de omcirkelde GFP-expresserende cellen: de cel die in het rood is omcirkeld, vertoont een zeer snelle afname in expressie tussen 18 en 20 uur na bombardement, terwijl de cel die in het wit is omcirkeld, een vertraagde start van de GFP-expressie vertoont. Naast de animaties maakt deze procedure een snelle kwantificering van de GFP-expressie over tijd in het doelweefsel van de limoenboon mogelijk. Deze representatieve resultaten tonen de vergelijkende kwantificering van de promoterintensiteit met gebruik van de CAMV 35 S-promoter en vier verschillende sojapromoters.

We hebben zojuist gedemonstreerd hoe DNA kan worden geïntroduceerd in de cotyledonen van kiemplanten. De Lima-boonzaden worden geplaatst op de cotyledon, er worden beelden verzameld voor beeldanalyse en deze beelden worden vervolgens geanalyseerd. We gebruiken deze procedure routinematig in ons laboratorium voor het valideren van promoter-klonen in planten.

Men kan een grote hoeveelheid gegevens genereren door de introductie van verschillende plantpromotoren. Deze procedure is echter complex en bevat vele stappen die mis kunnen gaan; bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te beginnen met verse bonenzaden of in ieder geval kwaliteitszaden te gebruiken die correct zijn bewaard. Het is daarnaast belangrijk om het bombardeer-deksel snel uit te snijden en op de robot te plaatsen, en om het dikke petrischaaldeksel te gebruiken om condensatieproblemen te minimaliseren.

En tot slot dient u erop te letten dat het GFP dat wij gebruiken een andere versie is genaamd SGFP, afkomstig van het Gen HIN Lab aan de Harvard University. Dit GFP is niet erg stabiel en is mogelijk geschikter voor het volgen van snelle veranderingen in genexpressie. Dat was alles, bedankt voor het kijken.

En veel succes met uw experimenten.