Multicolor Flow Cytometry Analyses van de cellulaire immuunreactie in resusmakaken
22 april 2010
Tonen we het nut van multicolor flowcytometrie voor gedetailleerde fenotypische en functionele karakterisering van het totaal en als het geheugen subsets van CD4 + en CD8 + T-cellen in rhesus makaken, het ideale model voor HIV / AIDS-vaccin studies.
Deze video demonstreert een procedure voor het stimuleren en kleuren van perifere mononucleaire bloedcellen of pbmc. Voor multicolor flowcytometrie-analyse worden de door Alec Watts geïsoleerde pbmc uit volbloed in weefselkweekplaten geplaatst. Cellen worden chemisch of biologisch gestimuleerd om een immuunrespons op te wekken.
Na stimulatie wordt een cocktail van antilichamen toegevoegd om celtypen te identificeren op basis van tot expressie gebrachte oppervlaktemarkers. De cellen worden vervolgens gepermeabiliseerd en een andere cocktail van antilichamen wordt toegevoegd om de expressie van intracellulaire cytokinen te detecteren; vervolgens worden de cellen geanalyseerd via flowcytometrie om de cytokinenprofielen voor specifieke subsets van pbmc te bepalen. Hallo, ik ben Amy Courtney uit het laboratorium van Dr. Jagan SAS in de afdeling Immunologie aan het University of Texas MD Anderson Cancer Center.
Hallo, ik ben Hong, ook uit het laboratorium. Vandaag laten we u een multicolor flowcytometrie-analyse van T-celresponsen zien. We gebruiken deze procedure in ons lab om cellulaire immuunresponsen bij Rhesusmacaakjes te bestuderen.
Laten we beginnen. Start dit protocol met een hemocytometer om de levensvatbare celgetallen van pbmc van Reuss Maca te bepalen middels de Trypan Blue-exclusiemethode. Werk hiervoor in een laminaire flowkast.
Suspendeer de cellen in compleet medium bij een concentratie van 10 miljoen cellen per milliliter voor aspecifieke stimulatie door 100 microliters van de celsuspensie in elke put van een 96-well weefkweekplaat te pipetteren. Voeg vervolgens 100 microliters medium toe dat PMA en CIN bevat om het totale volume op 0,2 milliliters te brengen, met een uiteindelijke concentratie van 50 nanograms per milliliter PMA en 500 nanograms per milliliter CIN; voeg voor de negatieve controleputten 100 microliters enkel compleet medium toe aan elke put. Incubeer de cellen gedurende 1,5 uur bij 37 degrees Celsius in een bevochtigde 5%carbon dioxide atmosfeer.
Voeg felden A toe aan de cultuur tot een uiteindelijke concentratie van 10 µg/mL en incubeer gedurende nog eens 4,5 uur. De felden A wordt toegevoegd aan trapp-cytokinen in het gold G-apparaat om de zichtbaarheid bij immunokleuring te verhogen; centrifugeer na stimulatie om het medium te verwijderen en was vervolgens door 200 µL koude flow-washbuffer toe te voegen en te centrifugeren bij een lage snelheid. Herhaal deze wasstap en resuspendeer vervolgens in 50 µL flow-washbuffer.
De cellen zijn nu klaar om te worden gekleurd voor de expressie van oppervlaktemarkers in elke put met resuspenderde cellen. Voeg één µL toe van de live-dead fixable aqua fluorescerende reactieve kleurstof, bereid volgens de instructies van de fabrikant. Incubeer 30 minuten bij 4 °C in het donker terwijl de cellen incuberen.
Bereid de kleuringsoplossingen die voor de feiten worden gebruikt in microbuisjes. Bereid eerst een kleuringscocktail door de volgende componenten op passende wijze toe te voegen: getitreerde fluorescentie-gelabelde monoklonale antilichamen, anti-CD3 PE SCI-7, anti-CD8 Alexa 700, anti-CD28 PerCP SCI-5.5, anti-CD95 APC en anti-CD4 Pacific Blue in Flow Wash Buffer.
Bereid vervolgens compensatiecontroles voor, die worden gebruikt om de spillover-coëfficiënten van elke individuele kleuring naar andere detectoren te bepalen door voor elke fluorescentgeconjugeerde antilichaam afzonderlijk een buis met een enkelvoudige kleurkleuring voor te bereiden. Bereid ten slotte fluorescence minus one- of FMO-kleuringen voor door alle reagentia te combineren, behalve degene waarvoor de analyse geldt. Deze worden gebruikt om de grens tussen een positieve en negatieve populatie te bepalen door autofluorescentieniveaus en gegevens uit volledig gekleurde monsters te dupliceren.
Nadat de cellen zijn geïncubeerd in de live/dead-kleuring, worden ze eenmaal gewassen met koud flow-wasbuffer om overtollige kleurstof te verwijderen; aspireer vervolgens de wasbuffer. Voeg daarna de voorbereide kleuringsoplossingen toe. Incubeer de cellen 30 minuten lang bij vier graden Celsius in het donker.
Was de gekleurde cellen met koud flow-wasbuffer om overtollige antilichamen te verwijderen. Voeg vervolgens 100 µL BD-fixatiepermeatiesolutie toe voor ten minste 10 minuten. Bewaar de cellen bij vier graden Celsius in het donker tot maximaal 24 uur voordat ze worden gebruikt, of ga verder met het labelen van de intracellulaire cytokinen om intracellulaire cytokinen te markeren.
Permeabiliseer eerst de cellen in 100 µL van een 1X perm. washbuffer; incubeer dit gedurende 10 minuten bij 4 °C in het donker terwijl de cellen incuberen. Bereid de kleuringsantilichamen, compensatiecontroles en FMO-controles voor in een 1X perm washbuffer zoals voorheen.
Nadat de cellen 10 minuten zijn geïncubeerd, worden deze gecentrifugeerd en wordt de 1x perm wash buffer verwijderd. Voeg de juiste kleurende antilichamen toe. Incubeer vervolgens de cellen en antilichamen na de incubatie gedurende 60 minuten bij vier graden Celsius in het donker.
Was de cellen twee keer met de permeatieoplossing. Resuspendeer de cellen na de laatste wasbeurt in 1% paraformaldehyde in DPBS om de cellen te fixeren. Bewaar de cellen gedurende maximaal 24 uur bij vier graden Celsius in het donker tot ze worden gebruikt.
Zodra de cellen zijn gekleurd, gebruikt u een LSR II flowcytometer of een CytoDP flowcytometer om FACS-analyse uit te voeren. Analyseer vervolgens de gegevens met FlowJo of vergelijkbare software. De samenstelling van PBMC's in rhesusmacaques werd bepaald via FACS-analyse.
Deze figuur toont het gating-schema dat is gebruikt voor de analyse van de verschillende T-cel subsets van een representatief dier. De lymfocyten werden eerst gegated via forward scatter FSC tegenover side scatter SSC, waarna levende lymfocyten werden geïdentificeerd op basis van de SSC- en AQUA-negatieve populatie. De T-cellen werden vervolgens geïdentificeerd door CD3-expressie; daarnaast werden binnen de CD3-positieve T-celpopulatie de CD4-positieve, CD8-negatieve en CD4-negatieve, CD8-positieve populaties bepaald.
De CD4-positieve en CD8-positieve T-cellen werden verder onderverdeeld in verschillende subsets op basis van CD28- en CD95-expressie als naïeve cellen, centrale geheugencellen en effector-geheugencellen. Deze figuur toont de productie van interferon gamma en IL-2 in ongestimuleerde en PMA/ionomycine-gestimuleerde CD4-positieve T-cellen en subsets.
Let op de verschillende cytokinenprofielen die door stimulatie worden opgewekt in elke subset. We laten u zien hoe u een multi-flowcytometrie-analyse van PBMC uitvoert.
Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om zowel compensatiecontroles voor enkelvoudige kleuren als fluorescent-minus-one controles in te stellen. Beide controles zijn noodzakelijk voor een correcte analyse van flowcytometriegegevens. Raadpleeg ons schriftelijke protocol voor meer informatie over het kiezen van compensatiecontroles.
Onthoud daarnaast dat het bij het gebruik van fluorescent gelabelde antilichamen belangrijk is om de monsters af te dekken om blootstelling aan licht te voorkomen. Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze video demonstreert een procedure voor het stimuleren en kleuren van mononucleaire cellen uit perifeer bloed (PBMC) voor multicolor flowcytometrie-analyse. De studie richt zich op de fenotypische en functionele karakterisering van CD4+ en CD8+ T-cel subsets in rhesusmacaqueapen, een model voor HIV/AIDS-vaccinonderzoek.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk gebied
- Immunologie
- Flowcytometrie
- HIV/AIDS-onderzoek
Achtergrond
- Rhesusmacaques worden gebruikt als model voor het bestuderen van hiv/aids.
- Inzicht in T-cel-subsets is cruciaal voor de ontwikkeling van vaccins.
- Multicolor flowcytometrie maakt gedetailleerde analyse van immuuncellen mogelijk.
- PBMC's zijn sleutelcomponenten bij het bestuderen van immuunresponsen.
Doel van de studie
- Om totale en geheugen-subsets van T-cellen te karakteriseren.
- Om multicolor flowcytometrie te gebruiken voor gedetailleerde immuunprofilering.
- Om het begrip van immuunresponsen in de context van hiv/aids te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Isolatie van PBMC uit volbloed.
- Chemische of biologische stimulatie van PBMC.
- Gebruik van antilichaamcocktails om celtypen en oppervlaktemarkers te identificeren.
- Analyse van cytokinestructuren met behulp van flowcytometrie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle stimulatie en kleuring van PBMC's voor analyse.
- Identificatie van specifieke T-cel-subsets op basis van oppervlaktemarkers.
- Karakterisering van intracellulaire cytokinenexpressie.
- Inzichten in immuunresponsen die relevant zijn voor HIV/AIDS.
Conclusies
- Multicolor flowcytometrie is effectief voor de analyse van T-cellen.
- Rhesusmakaakapen bieden waardevolle inzichten voor onderzoek naar HIV-vaccins.
- Het begrijpen van de dynamiek van T-cellen is essentieel voor de ontwikkeling van effectieve therapieën.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Multicolor flowcytometrie maakt nauwkeurige fenotypische en functionele profilering van T-celsubsetten in rhesusmacaques mogelijk, een cruciaal preklinisch model voor de ontwikkeling van hiv-vaccins. Deze benadering ondersteunt targetvalidatie door cytokine-producerende immuunresponsen te kwantificeren, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen in de vroege ontdekkingsfase. De methode vergroot de voorspellende betrouwbaarheid door antigeenspecifieke stimulatie te koppelen aan meetbare intracellulaire cytokine-outputs in gedefinieerde geheugenpopulaties.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de productie van IFN-γ en IL-2 in CD4+ en CD8+ T-celsubsets na stimulatie te meten.
- Operationele waarde: Biedt kwalitatieve en kwantitatieve maten van intracellulaire cytokineesexpressie om mechanistische ambiguïteit bij de validatie van immuuntargets te verminderen.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt biologische risicovermindering door gevoelige detectie van kleine antigeenspecifieke T-celfracties in PBMC-monsters van gevaccineerde dieren.
Screening en assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream workflows door gestandaardiseerde kleurings- en stimuleringsprotocollen vast te stellen voor reproduceerbare immuunprofilering.
- Operationele waarde: Pakt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid aan door het gebruik van compensatiecontroles en FMO-controles om nauwkeurige population gating te waarborgen.
- Wetenschappelijke waarde: Benadrukt de gereedheid voor screening door detectie van cytokineprofielen mogelijk te maken in naïeve, centrale geheugen- en effectorgeheugen T-cel subsets.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Bespreekt de relevantie voor de ziekte door intracellulaire cytokinemetingen in rhesusapen te koppelen aan HIV-pathogenese en door vaccins opgewekte immuunresponsen.
- Operationele waarde: Beschrijft de continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie door resultaten van PBMC-stimulatie te koppelen aan functionele T-celkarakterisering.
- Wetenschappelijke waarde: Richt zich op de voorspellende waarde voor risicoreductie door cytokineproductie te gebruiken als functionele readout voor de beoordeling van de immunogeniciteit van vaccins.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode bevindt zich binnen het ontdekkingscontinuüm, van vroege immuunprofilering tot identificatie van lead-moleculen, en ondersteunt het testen van hypothesen en de verduidelijking van pathways in modellen voor infectieziekten.
- Discovery Biology: Legt uit hoe de methode hypothesetoetsing ondersteunt door de cytokineproductie in specifieke T-cel-subsets te kwantificeren na PMA/ionomycine- of antigeenspecifieke stimulatie.
- Screening: Beschrijft de gereedheid van de assay via gestandaardiseerde stimulatie, oppervlakte- en intracellulaire kleuring en flowcytometrische analyse van PBMC-monsters.
- Analytics: Benadrukt metingen zoals de productiefrequenties van IFN-γ en IL-2, die vergelijking van immuunresponsen tussen condities en subsets mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt de methode met preklinische continuïteit door vaccin-geïnduceerde T-celresponsen in rhesusmacaques te koppelen aan functionele immuunprofilering die relevant is voor de ontwikkeling van HIV-vaccins.
- Enterprise Reuse: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit voor longitudinale immuunmonitoring van verschillende vaccinkandidaten en adjuvantformuleringen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen, targetvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit bij T-cel-gemedieerde immuunresponsen.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van multicolor flowcytometrie-assays voor immuunprofilering.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium binnen vaccinontwikkelingsprogramma's.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van kwantitatieve cytokinenprofielen in preklinische modellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in het ontwerp van flowcytometrie-panels, compensatie en gating-strategieën voor multicolor immunophenotypering.
- Behoeften op het gebied van instrumentatie en analytische infrastructuur, waaronder een flowcytometer (bijv. LSR II) en software (bijv. FlowJo) voor hoogdimensionale data-analyse.
- Eisen voor standaardisatie tussen teams voor stimulatiecondities, antilichaamtitratie en de opzet van controles (single-color en FMO) over verschillende laboratoria heen.
- Overwegingen voor adaptatie tussen modelsystemen, inclusaronder optimalisatie van stimulatieconcentraties en incubatietijden voor PBMC van niet-menselijke primaten.
- Praktische beperkingen ondersteund door het bronmateriaal: noodzaak van lichtbescherming voor fluorescerende antilichamen en zorgvuldige titratie om spillover in multicolor-panels te minimaliseren.
