Het bepalen van de reactiviteit en de titer van Serum met behulp van een hemagglutinatie Assay

Het bepalen van de reactiviteit en titer voor serum met behulp van een hemagglutinatie-assay. Hemagglutinatie is een reactie die plaatsvindt tussen oplosbare antilichamen en particulaire antigenen. Deze kunnen cellen of dragermoleculen omvatten.

Epitopen op het oppervlak van de drager maken het mogelijk voor een antilichaam om te binden en de drager te crosslinken, wat leidt tot de vorming van een complex rooster dat een antigeen-antilichaamcomplex wordt genoemd. Hemagglutinatie is een specifieke vorm van agglutinatie waarbij antilichamen binden aan rode bloedcellen, die fungeren als het particulaire antigeen. Rode bloedcellen zijn nuttige doelwitten omdat ze zowel gemakkelijk beschikbaar zijn als omdat de resultaten eenvoudig met het blote oog kunnen worden waargenomen.

Serummonsters worden serieel verdund en vervolgens in een 96-wells ubo-plaat geplaatst. Daarna wordt een suspensie van rode bloedcellen (Riva-cellen) toegevoegd. Wanneer antilichamen in een hoge concentratie aanwezig zijn, vindt binding aan de rode bloedcellen plaats, waarbij een groot rooster wordt gevormd.

Terwijl dit rooster door zwaartekracht bezinkt, vormt het zich naar de vorm van de ubo-plaat. Wanneer men van bovenaf kijkt, is een brede laag rode bloedcellen zichtbaar. Dit is een positieve hemagglutininereactie.

Wanneer de antilichaamsconcentraties laag zijn, kan er geen rooster ontstaan en volgen de rode bloedcellen de vorm van de UBO-plaat, waardoor ze zich op de bodem concentreren en een klein pellet vormen. Dit is een negatieve hemagglutinatiereactie. Dit diagram toont een positieve reactie.

Wanneer de cellen bezinken, vormen zij een rooster dat zich aanpast aan de vorm van de U-bodemplaat. Links en rechts zien we het bovenaanzicht, waarop een brede laag rode bloedcellen zichtbaar is. Als er een gemiddelde hoeveelheid antilichamen aanwezig is, zal er enige lettervorming worden waargenomen.

Hemagglutinatie maakt het ook mogelijk om de reactiviteit van verschillende serummonsters tegenover het bekende antigeen te testen. De titer van het serummonster kan eveneens worden bepaald. De titer is de laatste verdunning waarbij een positieve reactie werd waargenomen.

Normaal gesproken geldt dat hoe hoger de antilichaamconcentratie in de serummonsters is, hoe hoger de titer. Dit diagram laat een negatieve hemagglutinatiereactie zien. Er zijn onvoldoende antilichamen aanwezig om de rode bloedcellen te crosslinken.

Terwijl de cellen door zwaartekracht bezinken, glijden ze langs de wand van de well naar beneden en vormen ze een compacte pellet op de bodem. Het diagram rechts toont de rode bloedcellen zoals ze van bovenaf worden bekeken. Voor dit experiment heeft u één 96-well plaat met U-bodem nodig.

Het is essentieel dat een U-bodemplaat wordt gebruikt, aangezien platen met een vlakke bodem er niet in zullen slagen de cellen te laten sedimenteren tot een pellet, waardoor interpretatie onmogelijk wordt. Een pipet wordt gebruikt om 50 µL testserum, een 1% suspensie van Riva-cellen en een eenmalige oplossing van verone buffer saline in elke well van de rij te brengen. In well 1 tot en met 12 wordt 50 µL roal buffer saline gedoseerd.

Dit wordt gebruikt als uw verdunningsmiddel. Plaats nu 50 µL serum in well A1. Dit is uw eerste 1:2 verdunning.

Zorg ervoor dat het serummonster grondig is gemengd met behulp van de perpet. Haal na het mengen 50 µL uit putje A1 en breng dit over naar putje A2. Dit is uw tweede 1:2 verdunning, wat resulteert in een verviervoudige verdunning.

Zet deze verdunningsreeks voort met putjes drie tot en met 11. Plaats geen serum in putje 12, aangezien dit uw negatieve controle met royal buffer saline is. Neem nu uw 1% suspensie van Riva-cellen, die grondig is gemengd, en breng 50 µL over naar putje A1 tot en met putje A12.

Zodra de cellen zijn toegevoegd, wordt de plaat afgedekt en voorzichtig aangetikt om ervoor te zorgen dat de monsters en de cellen gemengd zijn. Incubeer vervolgens gedurende 60 minuten bij 37 °C. Een bevochtigde incubator is hiervoor geschikt.

Tijdens de incubatieperiode van 60 minuten zullen antigeen-antilichaaminteracties plaatsvinden en zullen de cellen beginnen te bezinken. De videobeelden die u bekijkt, zijn een time-lapse opname van de volledige periode van 60 minuten. Dit is een close-up van wells vijf tot en met 10.

We hebben reeds put 12 bekeken, wat in dit geval de VBS-controle was. De cellen hadden een compacte pellet gevormd, wat aangeeft dat de assay correct heeft gefunctioneerd. Put vijf en zes zijn voorbeelden van positieve hemagglutinatie.

Putje zeven is een voorbeeld van een intermediair agglutinatieresultaat, terwijl putjes acht, negen en 10 negatief zijn voor hemagglutinatie. Op basis van dit resultaat wordt de titer bepaald op basis van de verdunning voor putje zeven, aangezien dit het laatste putje was waarin een positieve reactie werd waargenomen.