Primaire menselijke bronchiale epitheelcellen gegroeid van Explantaten

In dit artikel beschrijven we een protocol voor de kweek en expansie van menselijke bronchiale epitheelcellen uit vers geïsoleerde menselijke bronchiale segmenten. Dit protocol bestaat uit vijf secties: coderen en krassen, honderd millimeter kweekplaten, herstellen van bronchiaal weefsel, explanttransplantaties van bronchiaal weefsel, passage van gecilieerde menselijke bronchiale epitheelcellen en menselijke bronchiale epitheelcellen op transwells. Let erop voordat u begint dat alle stappen in de biologische veiligheidskabinet worden uitgevoerd.

Tenzij anders vermeld, raadpleegt u de sectie over materialen, reagentia en preparatie en zorg ervoor dat u de basisvoorbereidingen heeft getroffen. De volgende zaken: codering, kweek van stamoplossingen, medium, dissociieoplossingen, coating en krassen, moeten in 100 mm kweekplaten worden uitgevoerd in de bst.

Houd alles steriel. Neem steriele kweekplaten van 100 mm en coatingoplossing. Pipetteer 2 mL coatingoplossing in een 100 mm plaat en draai deze rond om de bodem van de plaat te coaten.

Zorg ervoor dat de coating-oplossing de bodem van de plaat gelijkmatig bedekt. Pipetteer de resterende oplossing uit de plaat en gebruik deze om een tweede plaat van honderd millimeter te coaten. Herhaal dit voor zoveel platen als nodig is.

Het aantal benodigde platen varieert afhankelijk van het aantal weefselexplantaten. Zorg ervoor dat de coatingoplossing de bodem van de platen gelijkmatig bedekt, zoals gedemonstreerd.

Dek de platen af met hun deksels. Laat de platen één tot twee uur drogen in de incubator en aspireer de overtollige oplossing vóór gebruik voor bronchial weefselexplanten. Ongebruikte gecoate kweekplaten kunnen in een steriele zak worden geplaatst en bij vier graden Celsius worden bewaard voor later gebruik.

Reinig een kleine, scherpe schaar, een scalpel en pincetten met 70% ethanol en breng deze in de BSC. Maak krasjes in de gecoate platen door met het scalpel stevig te drukken om minstens vier kleine, diepe kruisjes (XS) per plaat te vormen. Als de krasjes niet diep genoeg zijn, zullen de weefselstukjes niet in de spuiten bezinken en zullen ze gaan drijven. Plaats het weefsel buiten de BSC in een P3-schaal. Spoel het geïsoleerde menselijke bronchiale weefsel grondig af in BSS.

Open de bronchiale stukken. Breng het weefsel over in de BS en breng het vervolgens over naar een steriele weefkweekplaat van 100 mm met gekoelde DMEM/F-12 aangevuld met 1% antibioticum-antimycoticum. Gebruik de kleine scherpe schaar om het weefsel in kubusjes van 2 tot 3 mm te snijden.

Plaats met een pincet één stukje gesneden weefsel in het midden van elke X en druk aan. Laat de weefselstukjes of X-explantaten enkele seconden zachtjes op de plaat hechten. Voeg daarna voorzichtig 10 ml compleet medium toe. Als het weefsel na toevoeging van het medium blijft drijven, gebruik dan een pincet om het weefsel in de groeven van de X te duwen of maak een nieuwe X. Het kan nodig zijn om nieuwe X'en te maken als de groeven niet diep genoeg zijn.

Plaats de platen in de incubator en ververs het medium elke drie tot vier dagen tot de weefsels klaar zijn voor transplantatie. Wanneer er voldoende epitheelcellen rond de weefsels zijn gegroeid om gebieden van één tot twee centimeter te bedekken, wat ongeveer vier weken duurt. Gebruik hiervoor gecoate en bekraste platen van honderd millimeter.

Aangezien sommige weefselexplantaties mogelijk niet succesvol zijn, hangt het aantal platen af van hoeveel weefselstukjes u transplanteert. Als u platen gebruikt die eerder zijn gecoat en bewaard bij vier graden Celsius, breng deze dan voor gebruik naar kamertemperatuur. Pak het weefsel voorzichtig op uit de oorspronkelijke plaat met een pincet, plaats het in het midden van de as in de nieuwe plaat en druk zachtjes aan. Weefsels zonder uitgroei moeten worden weggegooid.

Laat het weefsel aan de plaat hechten. Voeg gedurende enkele seconden medium toe en incubeer. Voeg toe zoals eerder beschreven voor X explan.

Voeg twee ml trypsin- en EDTA-stockoplossing toe aan elke 100 mm weefselkweekplaat. Verdun de stockoplossing met zes ml steriel 0,01 M PBS, zodat twee ml stockoplossing op zes ml PBS wordt gebracht voor een uiteindelijke concentratie trypsin van 250 µg/ml en EDTA van 100 µg/ml. Nadat de explantaten naar een nieuwe plaat zijn verplaatst, wordt het medium afgezogen van platen met ringen van cellen van één tot twee centimeter.

Voeg acht ml warme verdunde drips en edt-oplossing toe aan elke 100 mm plaat. Plaats deze in een incubator op 37 °C gedurende 3 tot 15 minuten. Controleer regelmatig.

Het te lang laten inwerken van trypsine zal de cellen beschadigen. Controleer de platen onder een microscoop om er zeker van te zijn dat de meeste cellen zijn losgekomen; de cellen worden rond en detacheren, zoals te zien is bij acht Mils van warmte. Voeg 10% FBS in medium per plaat toe om de EDTA-oplossing te inactiveren.

Combineer de volumes van alle platen in één buis of in afzonderlijke buizen per weefseltype. Tel de cellen met een Hema Cytometer en centrifugeer bij 100 G gedurende vijf minuten. Er zal zich een celpellet vormen op de bodem van de buis; resuspendeer het celpellet in compleet medium tot de gewenste celconcentratie.

Plaats telkens 2 tot 3 miljoen cellen per T 75-fles en voeg naar behoefte volledig medium toe. Incubeer en versnel het medium. Elke drie tot vier weken groeien de cellen tot sub-confluentie in de T 75-flessen.

Na ongeveer vier weken moeten de cellen worden geoogst en uitgebreid, of worden gebruikt bij subconfluentie om senescentie te voorkomen. Begin met het voorbereiden van de permeabele membranen van de transwells. Gebruik de inserts van 6,5 millimeter die passen in de 24-wells platen.

Voeg medium toe aan beide zijden van het membraan. Zes honderd microliter aan de onderzijde en 0,1 ml aan de bovenzijde. Incubeer één uur in een celkweekincubator.

Verwijder zorgvuldig het medium van beide zijden van het membraan. Begin eerst met het basale volume; wees voorzichtig, want het membraan kan gemakkelijk beschadigd raken. Pipetteer het medium daarom langs de wand van de kweekinsert en gebruik het aanbevolen volume.

Als dit niet gebeurt, zal het medium naar andere putjes lekken waarin cellen zijn gezaaid. Na pre-incubatie van de permeabele drager pipetteert u voorzichtig uw cel-suspensie op de apicale zijde van het membraan voor putjes van 6,5 millimeter, waarbij 0,1 ml cel-suspensie op de apicale zijde van het membraan wordt aangebracht. Pipetteer 0,6 ml medium op de basale zijde van het membraan.

Voed de cellen gedurende 10 dagen vanaf de apicale en basale zijden. Om een goed gedifferentieerde cultuur te verkrijgen, wordt het medium tweemaal per week vervangen. Verwijder het basale volume met de gedemonstreerde methode.

Vervang eerst het apicale volume en voeg 0,6 ml medium toe aan de basale zijde van het membraan. Deze methode bevordert de celadhesie aan het membraan en voorkomt dat cellen gedurende langere tijd aan lucht worden blootgesteld. Vervang het medium snel en plaats de cellen terug in een incubator.

Creëer op dag 10 een lucht-vloeistofinterface door het AAL-medium te verwijderen en de 0,6 ml medium aan de basale zijde van het membraan te vervangen. Houd de cellen gedurende zes weken in de lucht-vloeistofinterface en vers jellyfish het medium twee keer per week. Gecilieerde cellen zullen beginnen te verschijnen vier weken na de creatie van de interface.

Vloeistofinterface. Cellen zullen een uniforme differentiatie tot gecilieerde cellen bereiken. Zes weken na het aanmaken van de vloeistofinterface van het oor.

Menselijke bronchiale segmenten met gezonde epitheelcellen uit explantaten en transplantaten. In onze studie resulteerden explantaatculturen van bronchiaal weefsel in acht van de negen weefsels in succesvolle culturen. Omdat één van de explantaatculturen geïnfecteerd raakte, bereikten de ringen van epitheelcellen in drie tot vier weken een straal van één tot twee centimeter.

Succesvolle X-explantaat werden tot wel zes keer opnieuw gekweekt. Alle succesvolle culturen vertoonden bewijzen van celmigratie binnen 48 uur na het begin van de transplantaties, of X-explantaat zoals getoond in B-cellen hebben een kasseivormig uiterlijk dat kenmerkend is voor deze epitheelcellen zoals getoond in B. En in daaropvolgende figuren onthulde immunokleuring van cytosine-preparaten van cellen uit het explantaat en cellen gezaaid op dekglasplaatjes dat alle cellen positief waren voor het epitheelspecifieke cytokeratine; menselijke subcultuur van bronchiale cellen gegroeid tot subconfluentie in T 75-flesjes worden hier getoond. Let op het kasseivormige uiterlijk.

Menselijke subculturen van bronchiale cellen vertoonden een uniforme positieve immuunkleuring voor keratine en E.Can. Immuunkleuring met specifieke antilichamen tegen andere celtypen gaf geen enkele aanwijzing voor contaminatie van de culturen door fibroblasten, mesenchymale of endotheliale cellen. Raadpleeg voor meer details figuur vijf en de bijbehorende legenda in de tekst. Cellen die zijn gekweekt op permeabele polyester membranen of transwells met een vloeistofinterface differentieerden tot gecilieerd epitheel, zoals hier gedemonstreerd; gooi de cellen en hun transplantaten weg als er cellen met een andere morfologie dan hier getoond verschijnen. In dit protocol hebben wij gedetailleerde methoden gepresenteerd voor de kweek en expansie van primaire menselijke bronchiale epitheelcellen.

Studies op basis van menselijke cellen zijn noodzakelijk om belangrijke mechanismen van menselijke longziekten te bepalen en voor toxicologische en farmacologische screening van nieuwe geneesmiddelen. We hopen dat de hier beschreven methoden u zullen aanmoedigen om menselijke bronchiale epitheelcellen uit explantaten te kweken en deze cellen in uw studiesystemen te gebruiken. Bedankt en veel succes.