Analyse van de ontwikkeling van een morfologische fenotype als een functie van de eiwitconcentratie in gist

Dit protocol maakt gebruik van een reguleerbare promotor die een gecontroleerde eiwitexpressie mogelijk maakt. In dit experiment gebruiken we een high-copy two-micron plasmide dat het N-tweedomein tot expressie brengt vanuit een methionine-repressibele promotor. Wildtype gistcellen worden hiermee getransformeerd.

Plasmiden en transformanten worden geselecteerd op platen zonder uol. Na een nacht groei in selectieve media worden de cellen gesynchroniseerd door cortisol-gemedieerde groeistop.

Ten slotte wordt de expressie geïnduceerd door de cellen tijdens het tijdverloop-experiment over te brengen naar medium zonder methionine. De eiwitconcentratie wordt gemonitord via western blotting en de ontwikkeling van het morfologische fenotype via microscopie. Hallo, ik ben Claudia van de afdeling Biological Sciences aan de Purdue University.

Ik ben de Bari Muji in het alar en ik ben ook in het AL lab. Vandaag gaan we u een procedure laten zien voor de analyse van de ontwikkeling van een morfologisch fenotype als functie van de proteïneconcentratie in het lichaamsinduct. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de morfologische en moleculaire aspecten van een celdelingsfenotype te bestuderen dat wordt waargenomen bij overexpressie van het N2-domein van het endocytische adapterproteïne absent two.

Laten we beginnen. Dit protocol start met de constructie van een giststam die uw eiwit van interesse zal tot expressie brengen. In ons geval hebben we de wildtype giststam W 3 0 3 getransformeerd met high-copy plasmida-DNA dat nth twee bevat onder controle van de methionine-repressible promoter; twee millimolar methionine onderdrukt de activiteit van de met 25-promoter.

Hoewel medium zonder methionine een maximale expressie mogelijk maakt, kiest u zes koloniën van een plaat met onlangs getransformeerde cellen en inoculeert u deze in 50 milliliter selectief medium met 0,2 millimolar methionine in een conische kolf; incubeer dit de volgende ochtend gedurende de nacht bij 30 graden Celsius met schudden op 200 RPM. Schat de celdichtheid door de optische dichtheid van de cultuur bij 600 nanometer te meten. Breng het equivalent van 20 OD 600 nanometer per milliliter cellen over naar een steriele centrifugebuis en oogst deze door centrifugatie.

Resuspendeer de cellen in YPD-medium door te vortexen om de celcyclus te synchroniseren tot een uiteindelijke concentratie van 15 µg/mL vanuit een voorraadoplossing van 1 mg/mL in DMSO. Incubeer gedurende vier uur bij 30 °C onder schudden bij 200 RPM. Controleer na vier uur het percentage cellen dat in de mitose is gearresteerd.

Ga over tot de volgende stap door onder de microscoop te kijken en het aantal cellen met gelijkwaardige knoppen te tellen. Alleen als de groeistop groter is dan 90% worden de cellen geoogst door centrifugatie bij 2200 RPM gedurende vijf minuten. Na drie wasbeurten met ijskoud water wordt het pellet resuspendeerd in selectief medium zonder methionine bij een celdichtheid van ongeveer 0,5 OD 600 nanometer per milliliter.

Overdraag de helft van het celvolume naar een nieuwe steriele buis en voeg methionine toe tot een eindconcentratie van 0,2 millimolair. Dit dient als controle voor effecten als gevolg van basale niveaus van eiwitexpressie. Plaats beide culturen terug in de incubator van 30 graden Celsius.

Cellen worden elk uur gedurende zes uur geanalyseerd op fenotypeontwikkeling voor elk tijdstip. Breng één milliliter cel-suspensie van elke cultuur over naar een steriele microcentrifugebuis en oogst de cellen door centrifugatie, aspireer het supernatant en resuspendeer het pellet in 70 µL medium. Voeg vervolgens 30 µL methyleenblauw toe vanuit een voorraadoplossing van één milligram per milliliter in steriel water.

Pipetteer vervolgens ongeveer 6 µL van deze suspensie op een schoon glazen objectglas en plaats een dekglas over de druppel. Druk het dekglas voorzichtig aan om een dunne, uniforme laag cellen tussen de glazen oppervlakken te vormen. Verdeel het dekglas in negen kwadranten en maak drie opnamen per kwadrant.

Het aantal cellen per gezichtsveld mag niet groter zijn dan 30 cellen om een nauwkeurige kwantificering mogelijk te maken. Tel het aantal cellen dat het bestudeerde fenotype vertoont, wat in dit voorbeeld gistcellen zijn met verlengde en/of aaneengesloten knoppen die niet van elkaar scheiden. We tellen ook het aantal dode cellen, geïdentificeerd aan hun blauwe kleur, aangezien het celdelingsdefect wordt geïnduceerd bij nth.

Overexpressie van twee leidt tot celdood om fenotype-specifieke defecten op elk tijdstip te visualiseren. Pipetteer één milliliter van de cultuur in een steriele microcentrifugebuis en oogst de cellen door centrifugatie. Suspendeer de celpellet in 100 µL van een 1 mg/mL Calcein-AM-oplossing in steriel water en incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur in het donker.

Kleuring met calcior white maakt visualisatie van de celwand mogelijk. Was het pellet drie keer met 1x PBS. We suspenderen het uiteindelijke pellet in 100 µL PBS.

Observeer de cellen onder de microscoop en maak afbeeldingen bij een 100 x vergroting met UV-optiek om de celwand te visualiseren. Om GFP-gelabelde septine te visualiseren, worden afbeeldingen gemaakt met een FS E-filter. Kwantificeer het percentage cellen met celwanddefecten en mislokalisatie van septine met de eerder getoonde methode door het dekglas in negen kwadranten te verdelen en drie afbeeldingen per kwadrant te maken voor het tellen. TimeLapse-videomicroscopie van individuele gistcellen vereist in medium ingebedde agar-beds; om een agar-bed te maken.

Maak eerst een objectglas met een concave inkeping schoon met 70% alcohol en laat dit aan de lucht drogen. Terwijl het glas droogt, wordt 0,06 gram agros in vijf milliliter selectief medium zonder methionine in een magnetron gekookt tot de agros snel en volledig is opgelost. Pipetteer 200 microliter van het medium met agros op het objectglas.

Depressie en plaats daarna een ander schoon glazen dekglas er bovenop, waarbij u erop let dat er geen luchtbellen onder vast komen te zitten. Wanneer de gel gestold is, schuift u het bovenste glas voorzichtig weg van het depressieglas, terwijl u de oppervlakken te allen tijde parallel houdt. Dit zorgt ervoor dat het oppervlak van de agarosebed vlak is met het oppervlak van het depressieglas.

Maak het gebied op het objectglas rondom het agros-bed schoon met een zacht weefsel. Het objectglas is nu klaar voor gebruik na een tijd van vier uur. Breng één milliliter cellen van de cultuur over naar een steriele microcentrifugebuis en oogst deze door centrifugatie.

Aspireer het supernatant en resuspendeer de cellen in 100 µL vers selectief medium zonder methionine. Breng vaseline aan op de randen van het dekglas. Plaats vervolgens een druppel celresuspensie in het midden van het agros-bed en verspreid deze gelijkmatig door er voorzichtig een dekglas op te drukken.

Zegel de randen van het dekglas en fixeer de positie door de randen te voorzien van nagellak. Zodra de nagellak droog is, wordt het preparaat op de verwarmde tafel van een microscoop geplaatst. Wij maken gebruik van een Zeiss Axio 200 M-microscoop, uitgerust met een Zeiss Axio camm MRM monochrome digitale camera, om een beeldveld te kiezen dat niet meer dan 10 voldoende gespaciëerde cellen bevat, aangezien het veld na verloop van tijd voller zal worden.

Maak terwijl de cellen delen elke vijf minuten een afbeelding van het veld gedurende ongeveer vijf uur. Om te voorkomen dat de focus herhaaldelijk opnieuw moet worden ingesteld, programmeren we de software voor beeldacquisitie om automatisch een paar Z-stack-afbeeldingen bij elk tijdstip vast te leggen.

De afbeelding met de beste focus zal later worden geselecteerd voor het samenstellen van de film. Om ervoor te zorgen dat er voldoende warmte voor de cellen is, kan een externe warmtebron worden gebruikt, naast de verwarmde objecttafels, door het doorgelaten witte licht van de microscoop gedurende de gehele duur van de beeldvorming aan te laten staan. Fenotypische regressie kan worden bestudeerd door de afbeeldingen samen te voegen tot een film met behulp van Image J-software. Hier tonen we representatieve resultaten van de overexpressie van ons eiwit van belang. Nth two.

Ten eerste werd de eiwitexpressie van nth two bepaald gedurende het tijdsverloop van het experiment. Lysaten van cellen die HA nth two tot expressie brachten, werden geanalyseerd via western blotting met behulp van een monoklonaal anti-HA antilichaam. Zoals blijkt uit de immunoblot, vertonen cellen die zijn gekweekt in de aanwezigheid van 0,2 millimol methionine een minimale eiwitexpressie. Echter vertonen cellen die zijn gekweekt in medium zonder methionine een consistente stijging in de concentratie van S two gedurende het tijdsverloop van het experiment.

Vervolgens werden cellen geanalyseerd die gedurende zes uur waren gekweekt in de aanwezigheid of afwezigheid van methionine, aangezien een lage nth twee-concentratie niet in staat is om een phenotype van celdeling of uitsluitend celdood te induceren. Een klein percentage cellen is dood, zoals blijkt uit hun blauwe kleur na kleuring met methyleenblauw. Evenzo zijn het aantal kernen per cel, de celwand en de organisatie van septine normaal, zoals verwacht.

In tegenstelling hiermee leidt overexpressie van M twee tot een massaal defect in de celdeling en celsterfte, aangetoond door lange ketens van verbonden, verlengde knoppen die hun blauwe kleur behouden bij kleuring met methyleenblauw. De meeste fenotypische cellen zijn meerkernig, zoals aangegeven door DPI-kleuring. Calcior white-kleuring toont ophopingen van abnormale celwandplekken aan.

Daarnaast is septine sterk misgelokaliseerd en gedesorganiseerd. De kwantificering van het fenotype als functie van de tijd wordt getoond in deze grafiek, waarbij de open cirkels nul millimol methionine vertegenwoordigen en de gesloten cirkels 0,2 millimol methionine vertegenwoordigen. We zien hier dat naarmate de concentratie van nth twee in de cellen in de loop van de tijd toeneemt, het percentage cellen dat het celdelingsfenotype vertoont ook stijgt.

Controlecellen gekweekt bij 0,2 mM methionine tonen aan dat de fenotypeontwikkeling een functie is van de verhoogde proteïneconcentratie en niet het gevolg is van de kweekcondities. Tot slot wordt de fenotypeontwikkeling bij overexpressie van nth2 vastgelegd met time-lapse videomicroscopie.

Na vier uur nth vertonen twee overexpressiecellen een mild morfologisch celdelingsfenotype. Naarmate de film vordert, zien we abnormale en verlengde perioden van apicale budgroei, wat leidt tot zeer verlengde buds. We zien ook gebeurtenissen waarbij nieuwe buds ontstaan voordat er een celdelingsgebeurtenis heeft plaatsgevonden.

Bovendien is waargenomen dat er knoppen ontstaan uit verschillende regio's van de moedercel, wat leidt tot een vertakt uiterlijk. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe het ontwikkelingstraject van een morfologisch fenotype kan worden gekarakteriseerd en geanalyseerd als functie van de eiwitconcentratie bij gistknopvorming. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de cellen te centrifugeren bij de aanbevolen snelheden, aangezien hogere snelheden de cellen kunnen beschadigen.

Het is ook belangrijk om te onthouden dat methylene blue en chloride vlak voor de beeldvorming moeten worden toegevoegd, aangezien deze toxisch zijn voor light east-cellen. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.