DNA-gebaseerde Vissoorten Identification Protocol

Het systeem voor de identificatie van vissoorten is een eenvoudige, snelle en nauwkeurige DNA-gebaseerde methode om de aanwezige vissoorten in een gegeven monster te identificeren. Vismonsters worden behandeld met proteinase K om nucleïnezuren in oplossing te brengen. Het genomisch DNA van de vis wordt vervolgens geïsoleerd en via PCR geamplificeerd met behulp van primers die binden aan sequenties die in alle visgenomen voorkomen.

De PCR-producten worden vervolgens gedigesteerd met drie verschillende restrictie-enzymen en geanalyseerd met de Agilent 2100 bioanalyzer. De fragmentlengtes die ontstaan bij de digestiereacties kunnen worden gebruikt om de vissoort te bepalen met behulp van restrictiefragmentlengtepolymorfisme, of software voor RFLP-patroonmatching. Hallo, ik ben Rachel Formosa van Agilent Technologies.

Vandaag tonen we u een procedure voor de identificatie van vissoorten op basis van DNA. Deze procedure is een screeningsmethode waarmee u de vissoorten kunt identificeren die aanwezig zijn in verse, bevroren, gemalen, gekookte, gedroogde of anders bewerkte monsters. Dit kan worden gerealiseerd in minder dan één werkdag.

Wij gebruiken deze procedure om de authenticiteit van zeevruchten te bestuderen, wat van groot belang is voor de sector zeevruchten, aangezien substitutie en verkeerde etikettering aanzienlijke economische, milieu- en voedselveiligheidsgevolgen kunnen hebben. Bovendien kan het met name moeilijk zijn om vissoorten te bepalen via visuele identificatie en andere traditionele methoden. Zodra een vis is verwerkt, biedt DNA-onderzoek een veel nauwkeuriger en betrouwbaarder resultaat.

Laten we beginnen. Begin met het voorbereiden van de monsters voor DNA-extractie door 10 tot 1000 mg van elk rauw of gekookt visweefselmonster in 1,5 ml microcentrifugebuisjes per vis te plaatsen. Voeg 220 µL vers bereide proteinase-K-oplossing toe en pipetteer dit op en neer.

Incubeer de buisjes 10 minuten bij 65 °C en centrifugeer ze vervolgens drie tot vijf minuten bij 14.000 Gs om onverteerd weefsel te pelletteren. Breng daarna voorzichtig 150 µL van elk supernatant over naar een nieuwe buis van 1,5 mL, waarbij onverteerd materiaal aan de bodem en olieachtig materiaal aan de bovenzijde worden vermeden. Het supernatant wordt nu gebruikt voor de extractie van genomisch DNA.

Begin de extractie van genomisch DNA door 500 µL van de nucleic acid binding buffer aan elk monster toe te voegen. Hiermee wordt het totale monstervolume 650 µL. Vortex het monster tot homogenisatie.

Breng vervolgens elk monster over naar een DNA-bindende centrifugatiekolom die in een van de meegeleverde buisjes van twee milliliter is geplaatst. Klik de dop van het buisje op de bovenkant van de centrifugatiekolom. Centrifugeer de monsters gedurende één minuut bij 14 000 Gs om het DNA op de matrix van de centrifugatiekolom te laden.

Verwijder na de centrifugatie de spin-cups, gooi het filtraat weg en plaats de cups terug in de opvangbuisjes. Voeg 500 µL van een 1x high salt wash buffer toe. Sluit de buisjes af en centrifugeer opnieuw na de centrifugatie.

Gooi het filtraat weg en plaats de spin-cups opnieuw in de opvangbuisjes. Voeg nu 500 µL 80% ethanol toe. Sluit het buisje af en centrifugeer bij 14,000 G gedurende één minuut.

Herhaal de ethanolwas nog twee keer na de derde wasbeurt in 80% ethanol en gooi de filtraten weg. Plaats de spin cups terug in de opvangbuisjes en centrifugeer deze keer twee minuten om de fibermatrix te drogen. Draag de spin cups vervolgens over naar 1,5 milliliter opvangbuisjes.

Voeg 100 µL elutiebuffer toe aan elke spin-cup, direct op de vezelmatrix in de cup. Klik vervolgens de doppen van de opvangbuisjes op de spin-cups en incubeer deze gedurende één minuut bij kamertemperatuur. Centrifugeer de monsters na de incubatie gedurende één minuut op maximale snelheid.

Vervolgens werpt u de centrifugecup weg en sluit u de buisjes af. Indien de DNA-concentraties worden gemeten, worden concentraties verwacht die variëren van 5 ng/µL tot 500 ng/µL. Het DNA kan nu gedurende maximaal één maand worden bewaard bij 4 °C; voor langdurige bewaring plaatst u het DNA bij -20 °C of -80 °C.

Voer de PCR uit met de primers en reagentia die zijn meegeleverd in de P-C-R-R-F-L-P reagentkit. Volgens het bijbehorende schriftelijke protocol wordt aanbevolen om elk monster, inclusief de positieve controle en de no-template controle, in dubbeltoestanden te analyseren tijdens het PCR-proces. Bereid de mastermixen van restrictie-enzymen voor de digesties met DTE E one HAE three en NL three door de volgende componenten in deze volgorde te combineren: 1.5 µL steriel gedestilleerd water, 0.5 µL 10 x enzymbuffer en 0.5 µL 10 x enzym.

Bereid voldoende fourex three reagensmengsel voor voor alle monsters plus één reactievolume. Verdeel vervolgens 2,5 µl over elke reactiebuis die is gelabeld met de naam van het monster en het enzym. Wanneer de PCR is voltooid, haal je de monsters uit de thermocycler en plaats je deze op ijs.

Voeg 2,5 µL van elk PCR-product toe aan elk van de drie restrictiedigestiebuisjes voor die reactie. DDE één HAE drie, en NLA drie. Vortex vervolgens.

Centrifugegeef kort en incubeer de digesties gedurende twee uur bij 37 °C. Indien praktischer, kunnen de digesties ook overnight worden geïncubeerd. Incubeer na de digestie de reacties gedurende 15 minuten bij 65 °C.

Voeg vervolgens één µL 60 mM EDTA toe aan elke buis om de reactie te beëindigen en vortex deze. Bereid de restrictiedigest voor en laad deze, met behulp van de Agilent bioanalyzer reagent kit, in de wells van een DNA-chip volgens de handleiding van de kit. Voor elk monster moeten alle drie de digesten op dezelfde chip worden geladen.

Vortex vervolgens de chip en plaats deze in het apparaat. Nadat de run is voltooid, gaat u naar de assay-context en selecteert u het tabblad chip summary. Voer in het veld sample name een monsternaam in voor alle 12 wells van de chip om de vissoorten voor de test-DNA-monsters te identificeren.

Start het RFLP-decoderprogramma door op bestand te klikken. Open vervolgens het XAD-bestand. Het dialoogvenster voor openen wordt geopend.

Selecteer nu het XAD-bestand van de gebruikte DNA-chip. Klik op openen om een lijst met de op de chip geladen monsters te zien. Selecteer de drie digesten die horen bij het eerste DNA-monster.

Geef onder de kolom enzym de restrictie-enzymen op die zijn gebruikt in het veld met het label min peak height as percent of lower marker. De standaardwaarde is 10% indien nodig. Deze waarde kan worden verlaagd om kleine pieken te identificeren die over het hoofd zijn gezien, of worden verhoogd om pieken te verwijderen die het resultaat zijn van aspecifieke ruis in het elektroferogram.

Nadat u eventuele aanpassingen aan de waarde voor de minimale piekhoogte heeft aangebracht, klikt u op reintegrate. Klik vervolgens op calc onderaan het dialoogvenster. De fragmentlengtegegevens die zijn verkregen uit de bioanalyzer-run zullen de softwarevelden vullen.

Select vervolgens dice in de vervolgkeuzelijst voor de score in de linkerbovenhoek van het scherm. Als het vismonster uit één vissoort bestaat, of als het monster uit een mengsel kan bestaan, gebruik dan de tabel onderaan het scherm met het label combined score list. De beste soortovereenkomsten worden gebaseerd op de resultaten van alle drie de digestiereacties.

Perfecte overeenkomsten met een score van één zijn groen gemarkeerd. Bijna-overeenkomsten zijn geel gemarkeerd bovenaan het scherm. De onderste afkapwaarde geeft de minimale fragmentgrootte aan die in de analyse is gebruikt en de tolerantiewaarde voor overeenkomsten bepaalt hoe dicht de lengte van een fragment bij het voorspelde fragment moet liggen om als een overeenkomst te worden beschouwd.

De getoonde waarden zijn de standaardinstellingen en kunnen worden aangepast. Herhaal deze stappen voor de analyse van de resterende DNA-monsters op de tip. DNA-monsters van vier verschillende vissoorten werden geïsoleerd, geamplificeerd en gedigesteerd volgens de in deze video beschreven methode.

Een bioanalyzer-gel waarop de restrictiedigestie-monsters te zien zijn, wordt hier getoond met behulp van de Agilent Bioanalyzer en RFLP-decoder. Software-buigpatronen worden hier gebruikt om de vis te identificeren. Het eerste monster wordt correct geïdentificeerd als forel, het tweede als tonijn en het derde als zeebaars.

En het laatste monster als specifieke kabeljauw. We hebben u zojuist laten zien hoe u DNA-gebaseerde identificatie van vissoorten uitvoert met de PCR-RFLP-methode van Agilent. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om kruiscontaminatie van monsters te vermijden, aangezien de methode zeer gevoelig is.

Dat was het. Nu weet u hoe u snel, eenvoudig en nauwkeurig de vissoorten in uw monsters kunt identificeren. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.