Optische Scatter Microscopie op basis van twee-dimensionale Gabor filters

In deze video wordt optische verstrooiingsmicroscopie gebruikt om mitochondriale fragmentatie tijdens apoptose te kwantificeren. Hoewel optische verstrooiingsmicroscopie in dit protocol normaal gesproken geen fluorescentie vereist, worden er fluorescente beelden opgenomen voor validatiedoeleinden. Na de installatie van het beeldsysteem worden de cellen gelabeld met MIT tracker green en behandeld met staurosporine om apoptose te induceren.

Optische gegevens worden verzameld om veranderingen in de oriëntatie van cellulaire organellen binnen twee uur te detecteren. Het begin van mitochondriale fragmentatie kan worden gemeten met behulp van optische strooiingsgegevens, die een afname laten zien in de mate van oriëntatie van subcellulaire partikels. De gegevens worden vervolgens gevalideerd door de optische strooiingsgegevens te correleren met de fluorescente regio's die mitochondria bevatten.

Hallo, ik ben Nada Bustani van het Bio Optics Laboratory van de afdeling Biomedical Engineering aan de Rutgers University. Ik ben Rob Pak van het Bio Optics Lab, en ik ben Deen, ook van het Bio Lab. Vandaag laten we u een procedure zien voor het kwantificeren van subcellulaire morfologische dynamiek met behulp van een methode die niet afhankelijk is van fluorescerende kleurstoffen.

We gebruiken deze techniek in ons laboratorium om dynamische veranderingen in de subcellulaire structuur tijdens apoptose of geprogrammeerde celdood te bestuderen. Laten we beginnen. Start deze procedure door de handschoenen te steriliseren met 70% ethanol.

Plaats vervolgens een bereide 100 nM stockoplossing van MitoTracker Green en voorverwarm BAEC-celkweekmedium in de zuurkast met het licht uit en steriliseer alle oppervlakken. Plaats daarna een zes-wells kweekschaal met cellen die op dekglas zijn gezaaid onder de zuurkast. Gebruik hiervoor een Pasteurpipet die is aangesloten op een vacuümlinie.

Verwijder het celmedium uit de wells. Voeg vervolgens onmiddellijk twee milliliters van het gelabelde medium toe aan elke well om de mitochondria van de cellen te labelen. Dek de tissue culture plate af om blootstelling aan direct kamerlicht te voorkomen en plaats de cellen snel terug in de incubator.

Incubeer gedurende 45 minuten bij 37 °C terwijl de cellen incuberen. Bereid de optische opstelling voor: schakel eerst de kwikbooglamp in. Zet vervolgens de computer, de microscoopcamera's en de laser aan en sluit het digital micro mirror device of DMD aan in de roterende diffuser.

Kijk vervolgens door het oculair van de microscoop om te controleren of de optische koppeling is uitgelijnd. Het gezichtsveld moet helder verlicht zijn door het laserlicht. Om het monster te laden, plaatst u één tot twee kleine druppels immersie-olie op een 63 x olie-immersie-objectief terwijl dit volledig is neergelaten.

Plaats vervolgens op de tafel een objectglas met een raster van lijnen met regelmatige intervallen van 10 micrometer, genaamd de gradi, en breng het objectief omhoog zodat het olie de focus pakt. Stel daarna de zeshoekige rand van het condensorveld scherp. Stop zodra deze is uitgelijnd in centrale Köhler-verlichting.

De zeskantige rand moet in het oculair worden gecentreerd en scherp worden gesteld. Centreer vervolgens met de instelknoppen voor de diafragmastop van de condensor het condensorfeld over het gezichtsveld. Start IP lab en voer de instellingen in om de camera te bedienen.

Bevestig dat de camera is ingesteld op de frame transfer-modus. Voer het commando acquire focus uit om de live-preview te starten. Stel vervolgens het indexprefix en de bestandslocatie in waarin de afbeeldingen worden opgeslagen.

Start vervolgens de RS-beeldvorming. Stel de instellingen voor de bediening van de cool snap-camera in. De klokmodus moet worden ingesteld op normaal.

Start de DMD-software. Selecteer de dark field-iris in het scriptmenu. Klik vervolgens op laden en resetten.

Om het script handmatig uit te voeren, stelt u de optiv-balk van de microscoop in het viewport in op LSM. Hierdoor wordt het beeld via de DMD in de uitgelijnde optica gestuurd. Het donkerveldbeeld wordt geprojecteerd op de CCD van de Cascade five 12 camera.

Het donkerveldbeeld moet verschijnen in de live-preview in IP lab. Indien nodig, stel de scherpte van het beeld in de live-preview in. Stel de belichtingstijd hoog genoeg in om te garanderen dat er ten minste 10 000 counts aan signaal in het beeld aanwezig zijn.

Maak vervolgens een momentopname van het gezichtsveld met het commando 'acquire single' na de acquisitie. Gebruik het commando 'save as indexed' om de afbeelding op de schijf op te slaan. De afbeelding van de GTI meet de grootte van het gezichtsveld.

Verplaats nu het GTI-monster zodanig dat het buiten het gezichtsveld ligt en alleen de achtergrond zichtbaar is. Leg een achtergrondbeeld van het veld vast met een belichtingstijd die voldoende is om ten minste 5.000 counts te verkrijgen. Dit beeld zal helpen bij de achtergrondsubtractie van de ongefilterde beelden.

Om nu Gabor-gefilterde afbeeldingen van de achtergrond te verkrijgen, laadt u het script van de Gabor Filter Bank in de besturingssoftware van de DMD. Voer het volledige script uit om de filters in het onboard-geheugen van de DMD te bufferen. Zodra het volledige script is gebufferd, kan dit enkele minuten duren.

Gebruik de start- en stopmarkeringen in de DMD-software om ervoor te zorgen dat er telkens slechts één set filters wordt geladen die correspondeert met één Gabor-achtig filter. Voer het script uit om gefilterde afbeeldingen van de achtergrond te verkrijgen. De live-afbeeldingsvoorvertoning zou moeten veranderen van donkerveld naar de gefilterde afbeelding.

Open voor dat filter het acquisitiescript in IP lab vanaf de schijf. Pas de belichtingstijd aan om te garanderen dat er ten minste 2000 counts worden verworven. Terwijl het DMD-script wordt uitgevoerd, annuleert u de live-preview in IP lab en start u het acquisitiescript.

Hiermee wordt automatisch de index verkregen en wordt de gefilterde afbeelding op de schijf opgeslagen. Zodra de eerste afbeelding is verkregen, stopt u het script dat in DMD wordt uitgevoerd. Verwijder de gebruikte commando's uit het script.

Vervang vervolgens de start- en stopmarkeringen aan het begin en einde van de volgende filterset. Herhaal de acquisitie in het IP-lab totdat de gehele filterbank is gebruikt en alle gefilterde beelden zijn verworven en opgeslagen. Bereid het uitplaten van de cellen voor door een soldeerbout op de laboratoriumtafel aan te sluiten en het L 15-medium te verwarmen tot 37 °C.

Richt een werkstation in met een papieren handdoek en een Kimwipe om eventueel gemorst medium op te vangen en het gebied schoon te houden. Bereid verschillende lontjes voor door Kimwipes te scheuren en te draaien. De lontjes worden gebruikt om de vloeistof door de celplaat te trekken.

Gebruik vervolgens de metalen monsterhouder om een cel-sandwich te maken. Gebruik een spuit om een dunne rand vacuümvet aan te brengen langs de bovenste periferie van het gat in de bewerkte metalen plaat, waarbij het vet ongeveer tot halverwege de uiteinden van de groeven aan elke zijde reikt. Plaats voorzichtig een schoon nummer één dekglas op het vet.

Keer de plaat om en breng het vet aan rond het gat. Doe ethanol-gesteriliseerde NI-examenhandschoenen aan en schakel de kamerverlichting uit. Haal de cellen uit de incubator.

Verwijder het dekglas dat voor het experiment wordt gebruikt uit de zeswellsplaat. Droog het dekglas zorgvuldig. Druk vervolgens het dekglas met de celzijde naar beneden in de ingevette metalen plaat boven het kijkgat.

Klem de cellen in de plaat. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen achterblijven en dat het vet een waterdichte afsluiting heeft gevormd, zodat het medium kan worden geladen. Draai de plaat nu weer om en pipetteer telkens 200 microliters.

Voeg voorverwarmd L 15-medium toe aan de sandwich via de groef tussen het bovenste dekglas en de metalen plaat, totdat de vloeistof bijna de groef aan de andere zijde bereikt. Was vervolgens de cellen door een lont bij de tegenoverliggende groef te houden en nog eens 200 µL medium in de sandwich te pipetteren. Het medium zal van de ene naar de andere kant stromen terwijl de lont het oude medium verwijdert.

Zorg ervoor dat er tijdens deze stap geen luchtbellen in de vloeistof ontstaan. Herhaal dit proces twee tot drie keer, waarbij voor elke spoeling een nieuwe absorptiestrook wordt gebruikt. Keer de plaat nu nogmaals om, terwijl u de plaat bij de randen ondersteunt, om de vloeistof in het cellenreservoir te houden.

Dompel de soldeerbout in het bekerglas met veap om een kleine hoeveelheid veap snel te smelten, zodat dit aan de punt van de soldeerbout blijft kleven. Breng de gesmolten veap met de punt van de soldeerbout voorzichtig aan langs de randen van het onderste dekglas. Herhaal het dompelen en aanbrengen langs de volledige omtrek van het dekglas om het aan de metalen plaat te verzegelen.

Dit zorgt voor een goede mechanische afdichting, zodat het dekglas niet van de plaat loslaat tijdens de observatie. Verwijder eventuele resten van de onderzijde van het dekglas door een Kimwipe op te rollen en het glas hiermee schoon te maken.

Schuif het dekglas in één vloeiende beweging op het monster om te zorgen dat het centrum, waar de observatie plaatsvindt, het schoonst is. Plaats de plaat met zes putjes terug in de incubator. Breng de geplaatste cellen naar het optische laboratorium en monteer deze op het objectief.

Zoek, zoals voorheen, een veld met gezonde cellen en maak een dark-field-opname van het gezichtsveld. Stel vervolgens de microscoop in op DIC en zorg dat de belichtingstijden adequaat zijn. Maak een DIC-opname met een cascade-camera.

Bij deze opstelling worden fluorescentiebeelden vastgelegd met de cool SNAP-camera terwijl de microscoop nog is uitgelijnd in DIC. Stel de VAR van de microscoop in op één x, het viewport op 100%binoculair en leid het beeld van het oculair naar de camera. Plaats een blauwe LED boven de condensor om het veld te verlichten.

Bekijk vervolgens het gezichtsveld in het RSS-beeld en stel de fijne focus in. Indien nodig, neem een DIC-beeld op en sla dit op de schijf op. Let op hoe het gezichtsveld verschilt van datgene dat met de cascadecamera is verkregen.

Deze beelden moeten tijdens de analysefase van het experiment worden geregistreerd. Verschuif vervolgens de fluorescentiefilterkubus naar de juiste positie en leg een fluorescentiebeeld vast door de fluorescentie-excitatie kortstondig in te schakelen met de sluiter van de microscoop, en schakel deze onmiddellijk uit zodra de acquisitie is voltooid. Sla het fluorescentiebeeld op de schijf op om fotobleking te minimaliseren.

Om gefilterde beelden te verkrijgen, stelt u de microscoop opnieuw in op het gezichtsveld en stuurt u het licht door de LSM-poort. Voer, zoals eerder beschreven, het volledige Gabor-filterbankscript uit om de data-acquisitie voor één tijdstip te voltooien terwijl de cellen nog op de tafel liggen en zonder het gezichtsveld te verstoren. Gebruik de wicking-methode om het reguliere L 15-medium te vervangen door hetzelfde medium dat een 1 µM oplossing van STS bevat.

Voeg tijdens het experiment extra medium toe om uitdroging te voorkomen door medium in de groef van de celplaat te pipetteren, zonder deze van de tafel te verwijderen of het gezichtsveld te verstoren. Herhaal deze stappen nu voor de volgende tijdstippen tot het experiment is voltooid. De verzamelde gegevens zullen een groot aantal gefilterde beelden bevatten die verwerkt moeten worden om de subcellulaire structurele gegevens te extraheren.

Hier worden twee voorbeeldexperimenten getoond. Deze figuur toont opeenvolgende beelden van een monster van een mariene diatomee-alg. De georiënteerde kenmerken zijn duidelijk zichtbaar.

Bij dark-field imaging. De optisch gefilterde beelden, gelabeld van vijf gelijk aan 0 graden tot vijf gelijk aan 160 graden, worden getoond naast het ongefilterde beeld van het monster. Ter vergelijking is de set van negen Gabor-gefilterde beelden van de diatomee pixel voor pixel verwerkt voor de oriëntatie van het object.

Voor elke pixel werd het maximale signaal gedeeld door het gemiddelde signaal als functie van de filteroriëntatie om een aspectratio-waarde te verkrijgen. Hier gaf een aspectratio nabij één, aangeduid door blauw, gebieden aan waarin er geen voorkeursresponshoek is. Hogere waarden, aangeduid door rood, wijzen op gebieden waarin een hogere voorkeurshoekrespons aanwezig is.

De helderheid en codesignificantie van de totale GABOR-filterrespons, de filteroriëntatie die het maximale signaal per pixel geeft, komt overeen met de richting loodrecht op de oriëntatie van het onderliggende object. De oriëntatie van substructuurdeeltjes is gecodeerd in een quiverplot, waarbij elke lijn nauw overeenstemt met de onderliggende lokale objectoriëntatie die zichtbaar is in ongefilterd donkerveld. De quiverplot toont de oriëntatie van objecten met responsintensiteiten groter dan 10% van het maximum.

Deze dark-field en optisch gefilterde beelden tonen een veld met levende bovine endotheelcellen; de gefilterde beelden werden vervolgens elke 20 minuten verworven gedurende een periode van drie uur na behandeling met de apoptose-inductor staurosporine. Hier worden de aspectratio-kaart in het bovenste paneel en de fluorescentiebeeldvorming van mitochondriën in het onderste paneel weergegeven als functie van de tijd. De kleurtoon representeert de graad van oriëntatie; zoals eerder vertonen deze tijdplots de afname in de graad van oriëntatie van de aspectratio van de deeltjes in endotheelcellen behandeld met staurosporine, waarbij de individuele traces tijdplots binnen enkele cellen representeren.

De oriëntatie van de druppel is beperkt tot de regio's van de cellen die overeenkomen met de fluorescerende regio's. De validatie ten opzichte van fluorescentie is nu voltooid. Dit wordt gearchiveerd.

Kortom, in de volgende experimenten kunnen de mitochondriale metingen worden uitgevoerd door de stappen voor fluorescentie-imaging over te slaan en direct de optische verstrooiingsmethode te gebruiken. We hebben u zojuist laten zien hoe u mitochondriale fragmentatie tijdens apoptose kunt monitoren met behulp van lichtverstrooiingssignaturen op basis van Gabor-filters. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om een goede monsterpreparatie te hebben en ervoor te zorgen dat de optische opstelling goed is uitgelijnd en gekalibreerd.

Laten we dus kijken naar het gebruik van CoLab voor UI-experimenten.