Video Bioinformatica Analyse van menselijke embryonale stamcellen Colony Growth

Dit protocol demonstreert een bio-informatische videomethode voor het meten van de groei van menselijke embryonale stamcelkolonies door het analyseren van time-lapsevideo's die zijn verzameld in een icon bio station CT-incubator, uitgerust met een camera voor videobeelding. Menselijke embryonale stamcelkolonies (HESC) worden gekweekt tot een confluentie van 70%, opnieuw geplaatteerd en 48 uur geïncubeerd, waarna de HESC-kolonies gedurende nog eens 48 uur worden gefilmd in de Biot ct. De groeisnelheid wordt bepaald met behulp van segmentatieverbetering en meetrecepten die zijn ontwikkeld met CL quant-software.

De recepten zijn gevalideerd door vergelijking met Adobe Photoshop, een tool voor beeldanalyse waarmee handmatig nauwkeurige maskers op elke kolonie kunnen worden gepast. Het opkomende veld van de videobio-informatica kan worden gebruikt om de verwerking, analyse en extractie van biologische gegevens uit microscopische video's te automatiseren. Hallo, ik ben Serena Lin van het laboratorium van Dr. Prou Talbot van de afdeling Celbiologie en Neurowetenschappen hier aan de University of California Riverside.

Hoi, ik ben Sean Fino, ook van het Talbot Lab. Hoi, ik ben TI Satish van het Graduate Program voor Cel-, Moleculaire en Ontwikkelingsbiologie. Vandaag laten we u zien hoe u de groei van menselijke embryonale stamcelkolonies kunt meten met behulp van video-bioinformatica-tools.

Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de effecten van milieugifstoffen op het gedrag van menselijke embryonale stamcellen te meten. We zullen deze procedure demonstreren in onze nieuwe centrale faciliteit voor stamcellen. Laten we beginnen.

Om HESC voor video-analyse voor te bereiden, laat u HESC groeien op met Matrigel gecoate zes-wells platen totdat ze 70% confluent zijn; aspireer het medium uit één well met HESC en spoel deze twee keer met one milliliter PBS. Voeg one milliliter Accutane toe en incubeer gedurende one minuut bij 37 °C in 5% CO2. Voeg vervolgens 10 tot 12 glasparelletjes toe aan de well en schud de plaat voorzichtig totdat de kolonies volledig loslaten.

Neutraliseer Accutane met één milliliter onderhoudsmedium voor humane embryonale stamcellen of geconditioneerd medium van muisembryonale fibroblasten. Verzamel de losgekoppelde cellen zonder de beads in een conische buis van 15 milliliter en centrifugeer gedurende drie minuten bij 200 G. Decanteer het supernatant en resuspendeer de pellet met 500 µL vers onderhoudsmedium voor humane embryonale stamcellen of M-T-E-S-R. Pipetteer 100 µL van de HESC-suspensie druppelsgewijs in meerdere wells van een Matrigel-gecoate 12-wellplaat.

Schud de plaat voorzichtig heen en weer en observeer de culturen onder een lichtmicroscoop om te controleren of de celklonten gelijkmatig over de wells zijn verdeeld. Plaats de plaat in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 48 uur om ervoor te zorgen dat de cellen platgehecht zijn en groot genoeg zijn om gemakkelijk te visualiseren. Aspireer na 48 uur het medium en was de wells met 500 µL PBS om niet-gehechte cellen te verwijderen, en voeg vervolgens 500 µL M-T-E-S-R medium toe aan elke well.

Plaats de plaat onmiddellijk in de Biot CT en begin met het verzamelen van time-lapse beelden. Probeer velden te selecteren met afzonderlijke enkelvoudige koloniën die waarschijnlijk niet in andere koloniën zullen uitgroeien. In dit protocol worden de cellen gedurende nog eens 48 uur video-opgenomen met frames in intervallen van zeven minuten.

Om eerst het segmentatierecept te maken, scant u handmatig de gehele video om te controleren of deze één enkele kolonie bevat die gedurende de gehele opnameperiode in focus blijft. Open daarna de segmentatie-wizard in de CL quants-software en klik op de knop 'volgende'. Selecteer het juiste beeldkanaal en klik op de knop 'volgende'.

Kies 'soft matching' en klik op Next. Selecteer één of twee gewenste regio's door de buitenrand tot het centrale gebied van de kolonie te omcirkelen. Dit gebied moet zo klein mogelijk zijn, maar representatief voor de gehele kolonie.

Selecteer niet te veel regio's, omdat dit kan leiden tot een onnauwkeurige toepassing van het masker. Klik op de knop 'Volgende'. Selecteer 'Regio's niet gewenst' door regio's te omcirkelen die geen deel uitmaken van de kolonie en geen deel uitmaken van de achtergrond.

Deze regio's vertonen patronen die onderdrukt moeten worden, zoals debris en dode cellen. Klik op volgende. Selecteer de achtergrond door regio's te omcirkelen die geen kolonies, debris of dode cellen zijn.

De achtergrond moet uniform zijn en waarschijnlijk in elk frame verschijnen. Meestal selecteren we de grijze achtergrond rond de kolonie. Klik op de knop 'Volgende'.

Een gekleurd masker moet over het interessegebied worden weergegeven als het masker het interessegebied niet nauwkeurig bedekt. Het bereik van de segmentatiedrempel in de rechterbenedenhoek van het scherm kan worden verhoogd of verlaagd als een wijziging van het masker nodig is. Selecteer het bijwerken van zachte matchingregio's.

Hiermee kunnen de gewenste, ongewenste of achtergrondgebieden worden gewijzigd. Als het masker naar tevredenheid is, selecteer dan 'apply threshold' en 'save my mask'. Klik vervolgens op de volgende knop.

Het masker wordt vervolgens in een andere kleur weergegeven. Selecteer 'finish'. Het recept moet in de rechterbovenhoek van de software worden weergegeven als 'segmentation recipe'.

Hernoem het recept indien gewenst door met de rechtermuisknop te klikken en een nieuwe naam in te voeren. Om het recept toe te passen, klikt u met de rechtermuisknop en beweegt u de muis eroverheen.

Pas het recept toe. Er verschijnt een menu waarin het aantal te gebruiken frames kan worden geselecteerd. Stel het frame-interval in op elke 20 frames om de getrouwheid van het masker te waarborgen.

Controleer handmatig en willekeurig 10% van de frames waarop het masker is toegepast om een verbeteringsrecept te creëren dat ongewenste regio's in het detritus elimineert. Klik met de rechtermuisknop op de map met verbeteringsrecepten en klik vervolgens op nieuw. Er moet een nieuw verbeteringsrecept worden weergegeven vanuit het oorspronkelijke gezichtsveld.

Beweeg de muis over de pictogrammen in de werkbalk om de knop voor het in- en uitschakelen van de verbeteringsmodule rechts van de afbeelding te identificeren en klik erop. Selecteer het vervolgkeuzemenu voor etikettering. Selecteer etikettering voor verbonden selecteer etikettering voor verbonden twee.

Er moet een nieuwe taakbalk worden weergegeven. Pak het initiële masker uit het segmentatierecept en sleep dit naar het invoerveld. De balk moet nu het nummer van het invoermasker weergeven.

Sleep het icoon met het nummer van het invoermasker naar het icoon van masker nul. Zoek 'min size' in de taakbalk en pas het getal aan totdat alleen het relevante gebied (region of interest) wordt weergegeven. Zorg ervoor dat u op 'execute' klikt voor elke fitting-poging.

Zodra de aanpassing van de minimale grootte naar tevredenheid is verlopen, klikt u onderaan het scherm op het vorige verbeteringsrecept en selecteert u 'opslaan in recept'. De software vraagt nu om het geselecteerde recept te overschrijven; selecteer 'ja spot'. Controleer het verbeteringsrecept met dezelfde procedure als bij de spotcontrole van de segmentatie.

Als u tevreden bent met de recepten voor segmentatie en verbetering, gaat u verder met het maken van het meetsjabloon. Selecteer hiervoor 'create measurement template' in de werkbalk aan de rechterkant. Selecteer in het meetvenster 'move cursor over clip art cell figure'.

Houd de Ctrl-toets ingedrukt en selecteer de cel onder het gedeelte morfologie, vink de standaardparameter uit en vink de oppervlakteparameter aan. Sluit vervolgens het sjabloonvenster. Selecteer het pictogram.

Maak een meetrecept aan. Geef het recept een nieuwe naam. Ga naar het tabblad sjablonen en selecteer dit. Sleep in de rechterbovenhoek het eerder aangemaakte meetsjabloon naar het meetvenster.

Klik op ja om door te gaan in het venster voor het meetrecept en selecteer de kanaaltoewijzingen. Selecteer vervolgens de maskertoewijzingen voor de hele cel. Selecteer daarna de optie voor de hele cel. Voor een verbeterd masker selecteert u het meetrecept onder het tabblad recepten.

Selecteer in het hoofdvenster het opslagpictogram in het venster met het meetrecept. Sluit vervolgens het venster. Sluit daarna het gezichtsveld en open dit opnieuw. Klik met de rechtermuisknop op de map met de receptenlijst en klik vervolgens op 'nieuw'; sleep de recepten in de volgorde van de benodigde toepassing naar de receptenlijst, selecteer 'receptenlijst vergrendelen' en voer de recepten sequentieel uit op de videogegevens met Adobe Photoshop.

Elk 20ste frame van dezelfde kolonies werd geanalyseerd. Open handmatig een frame van een kolonieafbeelding in Adobe Photoshop. Klik op het selectiepen-instrument (magic wand tool) in de werkbalk.

Klik op het gebied rond de kolonie, zodat het hele veld wordt gedekt behalve de regio van de kolonie. Zorg ervoor dat de stippellijn rond de kolonie precies langs de periferie van de kolonie loopt en er niet binnenin valt. Als de stippellijn niet langs de periferie loopt, pas dan de tolerantiewaarde in de bovenste werkbalk dienovereenkomstig aan.

Klik op bewerken in de snelmaskermodus in de werkbalk en klik op de kolonie zodat deze is geselecteerd. Ga naar het venster, open het uitklapmenu en klik op histogram. De cache moet worden ingesteld op één.

Als de cache twee is, klik dan op het uitroepteken bij de expressie om de cache naar één te wijzigen. Noteer de pixelwaarde in een spreadsheet. Herhaal het bovenstaande proces voor elk 20ste frame.

Gegevens verzameld met Photoshop en CL quant-software kunnen vervolgens samen worden uitgezet. Ons protocol voor het kwantificeren van de groei van HESC-kolonies demonstreert een toepassing van video-bio-informatica op een biologisch probleem. Hier tonen we een grafiek waarin de toename van de koloniegrootte over 48 uur wordt vergeleken, zoals vastgesteld met behulp van CL quant-software en Adobe Photoshop.

De grafiek toont vijf verschillende kolonies die elk met beide softwarepakketten zijn geanalyseerd. Elke kolonie wordt weergegeven door een andere kleur. De doorgetrokken lijnen zijn afgeleid met behulp van sail quant-software, terwijl de stippellijnen met Photoshop zijn verzameld.

De grafiek van de ruwe gegevens laat zien dat beide meetmethoden goed overeenstemmen, rekening houdend met het feit dat kolonies een verschillende startgrootte hebben. Deze figuur toont de gegevens opnieuw uitgezet als de procentuele toename in koloniegrootte. De groeisnelheden zijn vergelijkbaar, ongeacht de startgrootte van de kolonie, en beide analysematen geven vergelijkbare resultaten.

De volgende grafiek toont de gemiddelden van de eerdere gegevens over de procentuele verandering in de groei van HESC-kolonies. Deze grafiek laat een goede overeenstemming zien tussen de analyse uitgevoerd met video-bioinformatica en Adobe Photoshop. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u de groei van menselijke embryonale stamcelkolonies kunt meten met behulp van video-bioinformatica-tools.

Wanneer deze procedure met fasecontrastmicroscopie wordt uitgevoerd, dient u ervoor te zorgen dat de halo rond de kolonie wordt meegenomen voor een nauwkeurige selectie van de kolonie door de software. Het is daarnaast belangrijk om te onthouden dat andere methoden voor het kweken, incuberen en videoverzamelen kunnen worden gebruikt in plaats van het protocol dat wij hebben gedemonstreerd. Zodra de recepten zijn ontwikkeld en gevalideerd, zullen ze de analyse veel sneller en met minder experimentele variatie uitvoeren dan handmatige analyse.

Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.