Eukaryotische Polyribosome Profiel Analyse

Het algemene doel van deze procedure is om de monozoom- en polyribosoomfracties uit cellysaten te scheiden en te vergelijken. Dit wordt bereikt door eerst de gewenste cellen te kweken. De tweede stap van de procedure is het bereiden van het cellysaat.

De derde stap van de procedure is het centrifugeren van het lysaat via een sucrosegradiënt. De laatste stap van de procedure is het fractioneren van de gradiënt en het visualiseren van de verschillende ribosomale populaties via een UV-trace. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die via polyribosoomprofielanalyse veranderingen in de translatie onder verschillende experimentele omstandigheden aantonen.

Hallo, ik ben Anthony Esposito van het laboratorium van Dr. Terry Goss Kinsey in de afdeling Moleculaire Genetica, Microbiologie en Immunologie aan de UMD en de J Robert Wood Johnson Medical School. En ik ben Marcus Lewis, ook van het McKinsey Lab hier aan de R-W-J-M-S.

Vandaag tonen we u een procedure voor polysoomanalyse. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om veranderingen in de eiwitsynthese te bestuderen die voortvloeien uit mutaties of omgevingsfactoren. Laten we beginnen. Sucrose.

Gradiënten moeten één dag voor gebruik worden bereid om te zorgen dat de gradiënten continu worden. Meng de juiste volumes van 7% en 47% sucrose-stamploplossingen om 48 milliliter van elk van de volgende sucroseconcentraties te maken: 7%, 17%, 27%, 37% en 47%. Voeg één molaire DTT toe aan elke sucroseoplossing tot een uiteindelijke concentratie van één millimolair. Om de gradiënten te gieten, bevestigt u een pasta-pipet aan een spuit van 20 milliliter door deze vast te zetten en af te dichten met parafilm.

Voeg zeven milliliters 7%sucrose toe aan de bodem van een poly aamer ultra centrifugebuis van one inch bij 3,5 inch. Voeg vervolgens zeven milliliters 17%sucrose-oplossing onder de 7%oplossing toe door de pasta-pipetpunt dicht bij de bodem van de buis te plaatsen en langzaam te pipetteren. Het gieten van elke laag moet niet minder dan 20 seconden duren.

Herhaal dit met telkens zeven milliliters sucrose-oplossingen van 27%, 37% en 47% zodra de gradiënt is gevormd. Er zouden duidelijke lijnen tussen de lagen zichtbaar moeten zijn, wat aangeeft dat er minimale menging heeft plaatsgevonden. Bewaar alle gradiënten bij vier graden Celsius gedurende de nacht, samen met de rotors, flessen en buizen die gebruikt zullen worden om monsters te oogsten.

Om extracten van gistcellen te bereiden, begint u met het kweken van 100 x 25 milliliters gistcultuur tot een OD 600 van 0,8 tot 1. Voeg cycloheximide toe aan de cultuur tot een uiteindelijke concentratie van 100 µg/mL en blijf 15 minuten schudden bij 30 °C. Giet de cultuur na 15 minuten in een centrifugefles van 250 milliliter en vul deze aan met ijs.

Houd alles vanaf dit punt op ijs; centrifugeer 5 minuten bij 8.000 ×g bij 4 °C. Resuspendeer het pellet in 10 mL ijskoud lysisbuffer en breng dit over naar 15 mL polypropyleen buisjes. Centrifugeer 3 minuten bij 5.900 ×g bij 4 °C. Resus.

Suspendeer het pellet in 0,5 milliliter lysisbuffer. Breng de suspensie over naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en voeg vervolgens 0,5 milliliter gekoelde, in zuur gewassen glaskralen toe. Vortex de cellen in vier intervallen van 32 seconden, waarbij de buis tussen elk interval 30 seconden op ijs wordt geplaatst.

Voeg vervolgens nog 0,5 ml lysisbuffer toe aan de 1,5 ml centrifugebuis en centrifugeer bij 5.000 ×g gedurende vijf minuten bij 4 °C. Overbreng de supernatant naar een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis en centrifugeer op maximale snelheid gedurende 10 minuten bij 4 °C.

Breng tot slot het supernatant over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Het extract kan worden bewaard bij minus 80 graden Celsius voordat het lysaat wordt overgebracht naar de sucrosegradiënt. Plaats de punt van de pipet tegen de wand van de buis vlak boven het oppervlak van de gradiënt en breng het lysaat voorzichtig als een laag bovenop de gradiënt aan.

Voor een gradiënt van 35 milliliter wordt gewoonlijk 500 microliter lysaat geladen. Plaats de gradiënt met een pincet voorzichtig in de bucket van een swinging-bucket-rotor. Centrifugeer de gradiënten bij 100 000 ×g gedurende vier uur bij vier °C.

Ongeveer 30 minuten voordat het vier uur durende centrifugeerproces is voltooid, bevestigt u de naald aan de buisdoorboring en de pen aan de online absorptie-fluorescentiemonitor. Schakel de stroom van de absorptiemonitor in, zodat er een stabiele basislijn kan worden bereikt voordat de monsters worden geanalyseerd.

De elektronische acquisitie van het PolyZone-profiel kan eenvoudig in realtime worden verkregen door een DI 1 48 U data-acquisitie-eenheid aan te sluiten. Vul, voor de grafische recorder, de spuitpomp met 50 milliliters florin nuts met behulp van de instelling voor snelle tegenstroom. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.

Verbind de slang van de spuit met de buisdoorboring. Zet vervolgens kort de Flo inert-stroom aan met een debiet van 6 mL per minuut in de voorwaartse richting. Plaats een reeks buisjes onder de slang aan het uiteinde van de flowcel om de monsteruitloop op te vangen en zo alle luchtbellen uit de slang te verwijderen.

Bereid een ijsbak voor met een vooraf gevormde uitsparing om de centrifugebuis met de sucrosegradiënt in te plaatsen. Wanneer de centrifugatie van vier uur is voltooid, worden de centrifugebuizen voorzichtig uit de centrifugerotor verwijderd en op ijs geplaatst. Zorg ervoor dat de gradiënten niet worden verstoord.

Plaats ter analyse van celextracten de gradiëntbuis op de buisdoorboorder, verbind de bovenkant van de buis met de uitlaat en zet deze vast. Til het onderste platform omhoog naar de centrifugebuis zodat de naald de bodem van de buis doorboort. Start de stroom van Florin alert in voorwaartse richting met een snelheid van 6 ml per minuut.

Zodra de vloeistof in de buis begint te stromen, dient de beweging van de naald op de online UV-absorptiemonitor te worden gevolgd. Zodra de naald begint te bewegen, moet de grafiekbeweging worden ingeschakeld op een snelheidsinstelling van 60. Wanneer het einde van het polyribosoomprofiel is bereikt, moet de stroom van Flo inert naar de centrifugebuis worden gestopt en de grafiekbeweging op de absorptiefluorescentiemonitor worden beëindigd.

Trek de Flo inert uit de centrifugebuis terug in de spuit door de stroming in omgekeerde richting op een hoge snelheid te starten, waarbij erop gelet moet worden dat er geen sucrose uit de buis in de spuit wordt getrokken. Schroef de centrifugebuis los van de buisdoorboorder, laat de naald zakken en verwijder de buis. Hier wordt een representatieve trace getoond van een ribosoomextract dat is bereid uit gist in aanwezigheid van cyclo heide.

UV-absorptiepieken die polyribosomen en 60 s en 40 s ribosomen bevatten, zijn aangegeven. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u een polyribosomanalyse uitvoert. Het is bij deze procedure belangrijk om snel te werken, de monsters koud te houden en RNA-vrij te werken.

Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.