Differentiatie van embryonale stamcellen in de oligodendrocyt Voorlopers
19 mei 2010
Beschrijven we een klein molecuul-gebaseerd protocol voor de differentiatie van muis embryonale stamcellen in de oligodendrocyt voorloper cellen (OPC's). Dit protocol genereert Olig2 + NG2 + OPC's met een hoge efficiëntie met 30 dagen van differentiatie. We beschrijven ook een methode om "spike" OPC's die kunnen vuren actiepotentialen genereren.
Het algemene doel van het volgende experiment is om oligodendrocyten-precursoren te genereren uit embryonale stamcellen via een reeks kweekstappen gedurende 30 dagen. Dit wordt bereikt door eerst embryolichaampjes te genereren uit muis-ES-cellen om de celdifferentiatie te initiëren. Als tweede stap worden de embryolichaampjes behandeld met de kleine moleculen retinoïnozuur en pure morfine, die de gestuurde differentiatie van de cellen tot een ligament induceren.
Cyte-precursoren. Als derde stap worden de embryo-lichamen na nog eens 22 dagen gedisaggregeerd tot enkelvoudige cellen. In cultuur bestaat ongeveer 80% van de cellen uit OPC's.
Vervolgens worden de uit MESC afgeleide OPC's getransduceerd met bao-virussen die de NAV 1.2-subeenheid dragen om spiking OPC's te genereren; de resultaten tonen de expressie van de OPC-marker en de spiking-eigenschappen van deze uit MESC afgeleide OPC's aan op basis van immunofluorescentiemicroscopie en elektrofysiologische registraties. Hallo, ik ben Pong Chiang van het laboratorium van Dr. Ing in de afdeling Celbiologie en Humane Anatomie aan de University of California Davis. We zijn ook verbonden aan het Shriners Hospital for Children of Northern California.
Hallo, ik ben Vial Raj, ook van het Deng-lab. Vandaag laten we u een procedure zien voor de differentiatie van muizen embryonale stamcellen naar oligodendrocyten-precursocellen. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de eigenschappen van uit embryonale stamcellen afgeleide oligodendrocyten-precursoren te bestuderen, met als doel cellen te genereren met een beter therapeutisch potentieel.
Laten we beginnen. Vandaag zullen oligodendrocyt-precursorcellen of OPC's worden gegenereerd uit de OG2-GFP muis embryonale stamcellijn. Deze embryonale stamcellen moeten elke drie dagen worden gepassaged om ze gezond te houden bij een optimale dichtheid en om spontane differentiatie te voorkomen. Passaging.
De ESS-cellen wanneer ze een confluentie van 70% hebben bereikt onder een laminaire flowkast. Verwijder het medium boven de cultuur. Spoel met PBS en trypsiniseer met twee milliliters voorverwarmde.
Incubeer één keer LE express gedurende vijf minuten bij 37 °C. Stop de reactie en resuspendeer de cellen in vier milliliter MES-celmedium. Breng de cellen over naar een conische buis van 15 milliliter en pellet deze bij 1000 RP gedurende vijf minuten.
Resuspendeer in een MESL-mediumplaat, waarbij een tiende van de cellen over een confluente laag bestraalde meth-feeders in MES-celmedium wordt geplaatst. Na drie dagen zijn de ES-cellen ongeveer 70% confluent en kunnen ze worden gepassageerd of gesuspendeerd om embryo-bodies te vormen. Om embryo-bodies te induceren en de differentiatie te starten, worden muizen-ES-celkolonies zoals voorheen met trypsine behandeld, waarna de cellen worden geresuspendeerd in knockout serum replacement of KSR-medium. Tel de cellen met een hemocytometer en verdun de suspensie in KSR.
Plate een medium met 15 000 cellen per milliliter door drie milliliter in elke put van een six-well plate met ultralage hechting te gieten. Kweek de gesuspendeerde cellen vier dagen lang bij 37 °C. Vervang het medium elke twee dagen volledig.
Vanaf dag vier wordt het medium dagelijks vervangen. Voeg op de vierde dag 0,2 µM retinoïnezuur toe aan het KSR. Voeg op de vijfde dag zowel retinoïnezuur als 1 µM primor famine toe. Voed de embryo-lichamen op de zesde en zevende dag met twee media, aangevuld met 0,2 µM retinoïnezuur en 1 µM primor famine. Na acht dagen in cultuur expresseren de meeste embryo-lichamen GFP en zijn ze klaar om te worden gedisaggregeerd; behandel met trypsine en tel de cellen zoals voorheen.
Resuspendeer ze vervolgens tot een concentratie van 3,5 × 10⁵ cellen per milliliter. Breng drie milliliter van de suspensie aan in OPC-medium. Gebruik hiervoor 60 millimeter schaaltjes die zijn gecoat met poly-ornithine. De cellen worden ongeveer elke week confluent en zullen er zo uitzien; pasgeageer de cellen vervolgens zoals voorheen met een trypsinisatie van drie minuten.
30 dagen na de oorspronkelijke resuspensie. In KSR-medium vertonen de cellen kenmerken van oligodendrocyten-precursorcellen om spiking OPC's te genereren. Gebruik muis ESL-afgeleide OPC's die tussen de 50% en 70% confluent zijn.
Vervang het medium door XPBS om de cellen te spoelen. Om het spanningsafhankelijke natriumkanaal 1.2 alfa-ondereenheid te introduceren.
We gebruiken de back MAM natriumkanaal-kit. Meng één milliliter back MAM component A met vier milliliter 1X PBS. Verwijder de PBS-spoeling en voeg het verdunde component toe.
Incubeer A gedurende twee uur bij 37 °C. Vervang het back memory-agens door OPC-medium dat is verrijkt met componenten B en C, zoals beschreven in de kit. Incubeer volgens de instructies nogmaals twee uur bij 37 °C.
Vervang na de incubatie het verrijkte medium door vers OPC-medium. Na nog eens 24 uur cultiveren kunnen de uit ESL afgeleide OPC's op dit tijdstip worden geanalyseerd op spiking. De EBS vertonen geen GFP-fluorescentie.
De EBS vertonen een sterke GFP-expressie en zijn ongeveer 30 dagen na de oorspronkelijke resuspensie klaar voor disaggregatiekweek. In KSR-medium zijn de meeste cellen immunopositief voor NG2-kleuring, wat consistent is met de GFP-expressie. In tegenstelling tot OPC's uit de hersenen slagen deze uit MES-cellen afgeleide OPC's er echter niet in om actiepotentialen te genereren, zelfs niet wanneer de cellen gedepolariseerd werden tot 0 mV.
Na het introduceren van de NAV 1.2-subunit via virale transductie, raken deze uit mES-cellen afgeleide OPC's geëxciteerd en vuren ze actiepotentialen. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe muizenembryonale stamcellen kunnen worden gedifferentieerd tot OPC's en hoe spiking OPC's kunnen worden gegenereerd via virale transductie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat retinoïnezuur, morfine en FGF2 correct bewaard moeten worden en dat er altijd verse aliquoten moeten worden gebruikt; gooi alle overtollige retinoïnezuur na gebruik weg.
Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het differentiëren van embryonale stamcellen van muizen tot oligodendrocyte-precursorcellen (OPCs) met behulp van kleine moleculen. De methode behaalt een hoge efficiëntie bij het genereren van Olig2+NG2+ OPCs binnen 30 dagen en bevat een techniek voor het produceren van spiking OPCs die in staat zijn actiepotentialen te genereren.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Stamcelonderzoek
Achtergrond
- Oligodendrocyten-precursorcellen (OPC's) zijn essentieel voor de myelinisatie in het centrale zenuwstelsel.
- embryonale stamcellen van muizen (ES-cellen) kunnen worden gedifferentieerd tot OPC's voor onderzoeks- en therapeutische doeleinden.
- Kleine moleculen kunnen het differentiatieproces effectief sturen.
- Inzicht in de eigenschappen van OPC's kan het therapeutische potentieel bij neurologische aandoeningen vergroten.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbaar protocol voor het genereren van OPC's uit muis-ES-cellen.
- Het onderzoeken van de elektrofysiologische eigenschappen van gedifferentieerde OPC's.
- Het verkennen van het potentieel van spiking OPC's in therapeutische toepassingen.
Gebruikte methoden
- Embryonale lichamen worden gevormd uit muis-ES-cellen om differentiatie te initiëren.
- Kleine moleculen, waaronder retinoïnezuur en pure morfine, worden gebruikt om differentiatie te induceren.
- Cellen worden gedisaggregeerd en gekweekt om OPC's te verrijken.
- Virale transductie wordt aangewend om voltage-gevoelige natriumkanalen in OPC's te introduceren.
Belangrijkste resultaten
- Ongeveer 80% van de gekweekte cellen wordt na 30 dagen geïdentificeerd als OPC's.
- Immunofluorescentiemicroscopie bevestigt de expressie van OPC-markers.
- Elektrofysiologische opnames tonen de spiking-eigenschappen van getransduceerde OPC's aan.
- Niet-getransduceerde OPC's vertonen geen actiepotentialen, wat de effectiviteit van de virale transductiemethode benadrukt.
Conclusies
- Het protocol genereert effectief OPC's uit embryonale stamcellen van muizen.
- Virale transductie zet OPC's succesvol om in spiking cells.
- Deze methode biedt een basis voor het bestuderen van OPC's in de context van neurologisch onderzoek en therapie.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Efficiënte differentiatie van embryonale stamcellen tot oligodendrocyten-precursorcellen (OPC's) voorziet in een kritieke behoefte aan schaalbare, lijngebonden celbronnen voor regeneratief onderzoek naar het centrale zenuwstelsel (CZS). Dit protocol maakt een hoge opbrengst mogelijk van fenotypisch gedefinieerde OPC's, wat bijdraagt aan de voorspellende betrouwbaarheid bij vroege targetvalidatie en functionele studies. De aanpak faciliteert mechanistische risicoreductie en portfolio-triage voor celgebaseerde therapeutische strategieën gericht op demyeliniserende ziekten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar de commitment van de oligodendrogliale lijn en padspecifieke eigenschappen mogelijk met behulp van gedefinieerde moleculaire markers.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door OPC's te genereren met consistente expressieprofielen van Olig2 en NG2.
- Vergemakkelijkt voorspellende zekerheid bij de functionele validatie van targets door middel van elektrofysiologische karakterisering van OPC-subpopulaties.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een reproduceerbare bron van gevalideerde OPC's voor downstream compound screening en fenotypische assays.
- Standaardiseert differentiatie-outputs, wat zorgt voor een kwantitatieve en schaalbare ontwikkeling van assays.
- Maakt een betrouwbare evaluatie van kandidaatmoleculen in ziektgerelevante oligodendrocyt-lijnsystemen mogelijk.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt in vitro OPC-modellen uit met fenotypen afgeleid van primair weefsel voor translationele continuïteit.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door functionele studies naar spiking en nonspiking OPC's mogelijk te maken.
- Faciliteert mechanische risicovermindering voor kandidaten in de celtherapie-pipeline die gericht zijn op demyelinisatie.
Integratie van Pipeline en Workflow
Dit differentiatieprotocol is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek, waardoor vroege targetvalidatie, assayontwikkeling en translationeel onderzoek naar de biologie van OPC's mogelijk wordt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing over lineage-committering en functionele OPC-eigenschappen.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare OPC-populaties voor kwantitatieve assay-platformen.
- Analytics: Biedt immunofluorescentie- en elektrofysiologische readouts voor vergelijkende analyse van OPC-subtypes.
- Translational Research: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en primaire weefselmodellen voor preklinische afstemming.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare workflow voor het genereren van OPC's over meerdere onderzoeksprogramma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in OPC-gericht onderzoek.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, schaalbare en reproduceerbare OPC-generatie voor cross-team workflows.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming en kapitaalefficiëntie in portfolio's voor celtherapie en neuroregeneratie.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van OPC-gebaseerde therapeutische kandidaten mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in stamcelkweek, differentiatie en virale transductietechnieken.
- Vereist toegang tot immunofluorescentiemicroscopie en infrastructuur voor elektrofysiologische registratie.
- Noodzaak van strikte standaardisatie van differentiatie- en assayprotocollen tussen teams.
- Kan aanpassing vereisen voor verschillende embryonale stamcellijnen of soortspecifieke modellen.
- Afhankelijk van een consistente reagentia-kwaliteit en nauwkeurige timing van de differentiatiestappen.
