Het isoleren van stamcellen uit Soft musculoskeletale weefsels

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van volwassen stamcellen uit musculoskeletaal zacht weefsel, zoals skeletspierweefsel. Dit wordt bereikt door eerst een biopsie van het zachte weefsel te nemen, dit te debrideren en fijn te hakken. De tweede stap van de procedure is het enzymatisch verteren van het weefsel.

De derde stap van de procedure is het isoleren van de stamcellen via herhaalde pre-platingstappen. De laatste stap van de procedure is de identificatie van de geïsoleerde stamcellen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die het morfologische en cellulaire gedrag van de cellen aantonen met behulp van immunofluorescentie, microscopie en/of flowcytometrie.

Hoi, ik ben y Lee van het Lab for Molecular Pathology van de afdeling Orthopedic Surgery aan de University of Pittsburgh. Vandaag laat ik u zien hoe u een volwassen stamcel isoleert uit de weke delen van het Mus skeletale systeem, zoals skeletspierweefsel. Hallo, ik ben Dr. Johnny Ward.

Ik ben professor aan de University of Pittsburgh School of Medicine binnen de afdeling Orthopedic Surgery. Ik heb nauw samengewerkt met Dr. Young Lee aan deze procedures om verschillende typen stamcellen te isoleren uit skeletspieren en andere weefsels, zoals vetweefsel. We gebruiken deze procedures in ons laboratorium om stamcellen te isoleren voor fundamenteel onderzoek naar toepassingen binnen de translationele geneeskunde.

Laten we beginnen met het onderzoek. De weefsels waaruit stamcellen kunnen worden geïsoleerd, omvatten pezen en skeletspieren geoogst uit de tibia of de soleusspieren van het achterpootje van wild-type muizen. Plaats, na het verwijderen van resten huid en bot, de weefsels in een schaal met koud HBSS aangevuld met 5% FBS.

Plaats het weefsel vervolgens afzonderlijk in met collageen gecoate schaaltjes met koud HBSS. We gebruiken skeletspierweefsels om de basisprocedures voor weefseldissociatie en digestie te demonstreren. Gebruik microschaartjes en/of scalpelbladen om de skeletweefsels fijn te hakken tot een grove slurry voor de enzymatische digestie van de weefsels.

Begin met het overbrengen van de MIT-weefselmengsels naar afzonderlijke buizen van 15 milliliter en centrifugeer deze bij ongeveer 3.500 RPM bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Verwijder de SANE-was door resuspensie in HBSS en herhaal de centrifugatie. Na het verwijderen van het supernatant worden de mengsels gedigesteerd door 10 milliliter voorverwarmde 0,2% collagenase toe te voegen.

Incubeer Type 11 gedurende 60 minuten bij 37 graden Celsius, waarbij de buisjes elke 10 minuten handmatig worden geschud. Centrifugeer na afloop van de incubatie van 60 minuten en resuspendeer de suspensies vervolgens in 10 milliliters DYS space solution. Incubeer gedurende 45 minuten bij 37 graden Celsius, waarbij elke 10 minuten handmatig wordt geschud. Centrifugeer na afloop van de incubatie van 45 minuten en resuspendeer de suspensies in 10 milliliters 0,2% trips in HBSS-oplossing.

Gewoonlijk incuberen we 15 tot 20 minuten bij 37 °C terwijl de buisjes elke 10 minuten worden omgekeerd, waarna de incubatie is voltooid. Wanneer er voldoende enkelvoudige cellen uit de weefsels zijn vrijgekomen, zoals hier geïllustreerd, centrifugeren we de resulterende cellen en resuspenderen we de celpellet in 5 mL proliferatiemedium (PM). Dissocieer de celsuspensie door het extract twee keer door een naald van 18 gauge, vervolgens één keer door een naald van 23 gauge en tot slot één keer door een naald van 27 gauge te leiden.

Breng tot slot het cel-extract door een 70 micron celzeef om de prepl-techniek te starten. Centrifugeer het zojuist geprepareerde cel-extract en resuspendeer de pellets in proliferatiemedium. Plateer vijf milliliters van het celmengsel op een met collageen gecoate T 25-fles en markeer deze als PP 1; incubeer gedurende twee uur bij 37 °C in een bevochtigde 5% carbon dioxide incubator.

Na twee uur worden de niet-adherente cellen overgeplaatst naar een nieuwe met collageen gecoate T 25-fles en gemarkeerd als PP twee. Voeg vijf milliliter PM toe aan de vorige T 25-fles, gelabeld als PP één.

Plaats beide kolven voor 24 uur terug in de incubator. Na 24 uur worden de niet-adherente cellen van PP twee overgebracht naar een nieuwe met collageen ENC gecoate T 25-kolf, die wordt gemarkeerd als PP drie. Voeg vijf milliliters proliferatiemedium toe aan de kolf met het label PP twee.

Plaats de kolven terug in de incubator. Herhaal deze procedure elke 24 uur tot populatie PP zes. De stamcelpopulatie is nu gecreëerd.

De geïsoleerde PP six-cellen zijn zeer gering in aantal en moeten worden onderhouden in proliferatiemedium rijk aan FBS. Dit moet dagelijks worden verschoond. De meeste cellen in de PP six-cultuur zullen echter sterven gedurende de volgende één tot twee weken van de cultivering.

Een grote gezonde PP zes populatie wordt gewoonlijk gecreëerd na een extra één tot twee weken expansie. Houd ook alle andere groepen gesuspendeerde cellen in stand, laat ze prolifereren en onderzoek ze regelmatig met een omgekeerde microscoop. De vroege hechtende cellen die aan de PP een en PP twee flessen hechten, zijn voornamelijk fibrotische cellen.

Cellen die na een langere periode van 48 tot 96 uur aan met collageen gecoate flessen hechten. PP drie en PP vier bestaan voornamelijk uit myoblasten. Terwijl spier-satellietcellen vaak vooral in PP vijf worden gezien, worden de latere prepl-cellen van 96 uur of later (PP zes) beschouwd als volwassen stamcellen en zien deze er klein, rond en doorschijnend uit.

Aan het begin van hun isolatie kunnen ze verder worden gekarakteriseerd middels immunohistochemie voor hun expressie van stamcelmarkers, zoals stem cell antigen one en CDC 34. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe stamcellen uit een secundaire massa van de muis kunnen worden geïsoleerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om gedurende alle stappen steriliteit te waarborgen.

Zodra de stamcel is geïsoleerd, dient u ervoor te zorgen dat deze cellen bij een lage dichtheid worden gekweekt om de stamceleigenschappen van de cellen te behouden. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw ervaring. Ik wens u veel succes bij het toepassen hiervan in uw experiment.

Dank u wel.