Human T-lymfocyt Isolatie, Cultuur en Analyse van de migratie In Vitro

Migratie van T-lymfocyten vindt plaats tijdens het homing-proces naar lymfoïde organen, het verlaten van de vasculatuur en het binnendringen van perifeer weefsel. Dit proces omvat de adhesieve interactie van het T-celoppervlak met andere cellen. Om dit fenomeen in vitro te onderzoeken, worden humane T-lymfocyten geïsoleerd, gekweekt en geplaatst op weefselkweekplaten die zijn gecoat met het adhesieve eiwit.

ICAM 1 en chemokine SDF 1. Beelden van T-lymfocytmigratie kunnen vervolgens worden verkregen en geanalyseerd. Hallo, ik ben Craig LeFort uit het laboratorium van Minsu Kim aan het Center for Vaccine Biology and Immunology van de University of Rochester.

Vandaag laten we u een procedure zien voor de isolatie en kweek van menselijke T-lymfocyten en een analyse van hun migratie in vitro. We gebruiken deze assay in ons laboratorium om de rol van integrines en T-celmigratie te bestuderen. Het belangrijkste integrine in T-cellen is lymfocytfunctie-geassocieerd antigeen 1 of LFA-1.

De specifieke liganden voor LFA-1 zijn de ICAMs, zoals ICAM-1. Daarnaast is een kine-signaal vereist voor T-celmigratie om zowel een richtingsignaal te geven als om integrines te activeren. In onze assay gebruiken we menselijk ICAM-1 en CXCL12 of SDF-1 als substraten voor T-celmigratie.

Laten we beginnen. Nadat menselijk bloed van een gezonde donor is verkregen, laat u het bloed afkoelen tot kamertemperatuur. Dit duurt ongeveer 30 minuten.

Zodra het bloed is afgekoeld, pipetteer dan voorzichtig drie milliliters polymorf density gradient medium op kamertemperatuur in een polystyreen buis met een ronde bodem van acht milliliter. Voeg vervolgens voorzichtig drie milliliters volbloed toe aan de bovenkant. Het is belangrijk om menging te voorkomen.

Plaats de buizen in een centrifuge en centrifugeer deze 500 G gedurende 45 minuten. Na de centrifugatie bij kamertemperatuur zijn de perifere bloedmononucleaire cellen of PBMC's gescheiden van de overige bloedcomponenten. De PBMC-laag is zichtbaar als de eerste troebele band vanaf de bovenkant.

Verwijder onder steriele omstandigheden voorzichtig de heldere, geelgekleurde bovenfase en gooi deze weg. Gebruik vervolgens een P 1000 micropipet om de PBMC-laag over te brengen naar een nieuwe conische buis. Was de PBMC's tweemaal met PBS door de cellen vijf minuten te centrifugeren bij 500 G.

Na elke wasbeurt zal het supernatant enigszins troebel zijn. Resuspendeer de cellen in 20 milliliters RPMI 1640-medium bevattend 10% FBS, 1% penicilline-streptomycine en één microgram per milliliter fytohemagglutinine of PHA. Incubatie in aanwezigheid van PHA induceert T-lymfocytenactivatie en -expansie.

Overbreng de pbmc met een pipet naar een T 75 kweekfles. Incubeer deze vervolgens bij 37 °C en 5% koolstofdioxide gedurende 1 tot 24 uur. Deze stap maakt het mogelijk om monocyten, die aan het oppervlak van de fles hechten, te scheiden van de lymfocyten die in suspensie blijven.

Verwijder na de incubatie voorzichtig al het medium, dat hoofdzakelijk lymfocyten bevat, en breng dit over naar een conische buis van 15 milliliter. Centrifugeer 5 minuten bij 500 G. Resuspendeer de celpellet in RPMI 1640 en breng de cellen over naar een nieuwe T 75-fles met 25 milliliters RPMI 1640 met FBS, penicilline, streptomycine en PHA, en incubeer bij 37 graden Celsius.

Na 24 uur groei kan het nodig zijn om 15 tot 20 milliliter vers medium toe te voegen en de cellen over te brengen naar een grotere T 1 75-fles. Zet de incubatie voort gedurende drie of twee dagen. Indien de initiële incubatie van PBMC na drie dagen een nacht duurde, verwijder dan het medium met een pipet, waarin de gesuspendeerde lymfocyten zich bevinden, en breng dit over naar een conische buis van 50 milliliter; centrifugeer vervolgens bij 500 G gedurende vijf minuten.

Reese heeft het celpellet geoogst en de cellen overgebracht naar een nieuwe T 75-fles die 25 milliliters RPMI 1640 bevat. Voeg FBS, penicilline, streptomycine en menselijk IL 2 of IL 15 toe en plaats de cellen in de incubator. Bij het starten met een T 75-fles moet de cultuur worden uitgebreid en overgebracht naar een T 1 75-fles.

Laat de lymfocyten na één tot twee dagen in totaal vier tot zeven dagen groeien. Coat één dag voor de migratie-assay een glazen bodem schaaltje van 0,17 millimeter met 20 micrograms per milliliter proteïne A of G in PBS en incubeer dit overnacht bij vier degrees Celsius. Was het schaaltje de volgende dag uitgebreid met PBS en voeg vervolgens ICAM one FC en humaan SD F1 in PBS-oplossing toe aan het schaaltje.

Incubeer gedurende vier uur bij kamertemperatuur om de moleculen te immobiliseren. Bepaal de dichtheid van de gekweekte cellen met een hemocytometer. Was daarna de lymfocyten tweemaal met PBS en resuspendeer ze in één milliliter L 15-medium met D-glucose. Was na de incubatie de gecoate schaal met ICAM-1 FC en SDF-1 uitgebreid met PBS. Breng de T-lymfocyten in één milliliter medium over naar de schaal; er moeten ongeveer 2 tot 5 × 10⁵ cellen per schaal worden gebruikt om een celdichtheid te bereiken die geschikt is voor migratieanalyse.

Om beelden van celmigratie te verkrijgen, plaatst u de schaal op de microscooptafel in een temperatuurgecontroleerde omgeving, zoals een verwarmde kamer bij 37 °C. Open de NIS elements-software in het menu voor beeldinstellingen. Kies voor 2x2 binning als modus voor zowel live-imaging als beeldopname.

Ga naar het toepassingenmenu en selecteer 'define, run, experiment'. Kies de tijdsinterval tussen de beelden en de totale tijdsduur. Druk voor de beeldvastleggingssequentie op de startknop om te beginnen met de acquisitie van beelden na de opname.

Migratieparameters zoals snelheid, padlengte en verplaatsing kunnen worden gekwantificeerd met behulp van een softwarepakket zoals Image J Auto Quant of veloc. Om een spider web plot te genereren, verzamelt u de XY-coördinaten voor elke cel en elk tijdspunt en projecteert u deze op een grafiek met een gemeenschappelijk startpunt voor elke cel in de oorsprong. De hier getoonde T-lymfocyten werden gekweekt op ICAM en SDF one en elke 10 seconden gedurende 30 minuten afgebeeld.

Deze film toont de willekeurige migratie van T-lymfocyten met een snelheid van ongeveer 15 microns per minuut, waarbij de XYT-coördinaten voor elke cel worden gebruikt. 15 cellen werden willekeurig gekozen en uitgezet met een gemeenschappelijk startpunt in de oorsprong. Het vergelijken van spinnenwebdiagrammen geeft een snelle visuele weergave van verschillen in migratie tussen verschillende experimentele condities.

Grafieken voor T-lymfocytenmigratie onder controlecondities worden links weergegeven, terwijl grafieken voor T-lymfocytenmigratie in aanwezigheid van een blokkerend antilichaam tegen de LFA-1-ligand rechts worden getoond. Deze gegevens tonen aan dat T-lymfocyten integrine LFA-1 gebruiken om te migreren op een ICAM-1-substraat. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u een migratie-assay uitvoert met gekweekte menselijke T-lymfocyten tijdens de procedure.

Het is belangrijk om eraan te denken een passend aantal cellen aan de met ICAM-1 gecoate schaal toe te voegen, zodat de celtracking en de analyse van de migratie worden vereenvoudigd. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.