Een omgekeerde genetische benadering van functionele redundantie Test tijdens de embryogenese

Het algemene doel van deze procedure is om vast te stellen of twee genen functioneel redundant zijn voor de specificatie van een gedefinieerde cellijn. Dit wordt bereikt door eerst het loss-of-function fenotype van elk individueel gen te definiëren met behulp van genspecifieke morphino's die worden geïnjecteerd in zich ontwikkelende zebravisembryo's. De tweede stap van de procedure is het ontwikkelen van een assay voor het kwantificeren van de specificatie of differentiatie van de cellijn.

Bijvoorbeeld door gebruik te maken van een reporter-vislijn, zoals we hier zullen laten zien. De derde stap van de procedure is het combineren van twee morph FENO's om gelijktijdig het functieverlies van beide genen te targeten. De laatste stap van de procedure is het evalueren van het fenotype dat wordt veroorzaakt door de dubbele knockdown.

Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die verlies of winst van functie aantonen voor cellen van een specifieke lineage door onderzoek van de lineage-reporter of analyse van de expressie van een lineage-specifieke marker. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het combineren van knock-outs in het muismodel, is dat twee of zelfs drie genen in het vismodel kunnen worden getarget door simpelweg gevalideerde morphino's in één enkel experiment te combineren. Meer dan 100 embryo's kunnen worden geïnjecteerd en de fenotypes kunnen gedurende meerdere dagen worden geëvalueerd.

Deze methode kan helpen om kernvragen te beantwoorden. In de ontwikkelingsbiologie, zoals bij het definiëren van de transcriptionele routes die het cellot bepalen, worden belangrijke regulerende routes vaak vertegenwoordigd door kleine families van verwante genen die functioneel redundant zijn. Hun rol is daarom niet duidelijk uit knockout-studies bij muizen vanwege compensatie door zustergenen.

Hoewel dit model inzicht kan bieden in de embryogenese van zebravis, kunnen de resultaten worden toegepast op andere systemen zoals de muis, aangezien dezelfde genetische programma's doorgaans goed geconserveerd zijn gedurende de evolutie. Bereid de microinjectieplaten voor voordat de embryo's worden geïnjecteerd. Giet ongeveer 12 milliliters van 2% agrose in systeemwater, wat schoon water is dat direct uit het vistanksysteem is gehaald, in het omgekeerde deksel van een 100 millimeter Petrischaal.

Plaats twee microscoopglaasjes onder een hoek van ongeveer 45 graden tegen de twee zijden van het deksel. Wanneer de agarose is gestold, trek de glaasjes voorzichtig weg van het deksel, waardoor er geulen ontstaan waarin de embryo's zullen rusten tijdens de injectie. Morpholino-stocks worden bij kamertemperatuur bewaard in een concentratie van 1 mM in steriel gedestilleerd gedeïoniseerd water vóór de injectie. Incubeer de morpholino-stocks vijf minuten bij 65 °C om ervoor te zorgen dat ze volledig in oplossing zijn.

Laat de voorraden afkoelen tot kamertemperatuur. Elke nieuw ontworpen morpho moet empirisch worden gevalideerd op activiteit en embryotolerantie. Start in microcentrifugebuisjes met één tot twee seriële verdunningen van de morpho-voorraad in gedestilleerd gedeïoniseerd water, resulterend in werkconcentraties van 1 millimolair, 0,5 millimolair, 0,25 millimolair en 0,125 millimolair.

Gebruik onder een dissectiemicroscoop zuigkracht om een gekalibreerde injectienaald, die aan de micromanipulator is bevestigd en correct is gepositioneerd, van voren te vullen. Vul de naald met ongeveer one microliter van de morpho-oplossing met de laagste concentratie. Gebruik een transferpipet om bevruchte embryo's in het eencellige stadium over te brengen naar de troggen van de micro-injectieplaat.

Gebruik de pipet om overtollig water uit de plaat te verwijderen, zodat de embryo's naar de bodem van het reservoir zakken. Plaats de injectieplaat onder de microscoop, breng de naald door het chorion en in de dooier. Injecteer elk embryo voordat de naald wordt verwijderd en de injectieplaat opnieuw wordt gepositioneerd om het volgende embryo te bereiken.

Bij het leren injecteren kan het nuttig zijn om een vitale kleurstof te gebruiken om de injectie in de cel te visualiseren zoals hier wordt getoond; breng de embryo's terug naar een Petri-schaal van 100 millimeter met systeemwater en kweek ze bij 28,5 °C. Verwijder alle resterende morpholino-oplossing uit de naald en vul deze met de eerstvolgende hogere concentratie morpholino om de volgende batch embryo's in het juiste ontwikkelingsstadium te injecteren. Onderzoek de embryo's op fenotypes bij elke geïnjecteerde morpholino-concentratie.

De drempeldosis voor elke morphino is de laagste dosis waarbij een gedefinieerd, betrouwbaar fenotype optreedt. Meerdere titratierondes kunnen nodig zijn om een onnauwkeurige drempelwaarde te definiëren. Om te zoeken naar een genetische interactie tussen twee verschillende genen.

Bereid een mengsel voor van twee morpho's van belang, elk in de respectievelijke drempelconcentratie. Het is belangrijk om er rekening mee te houden dat de embryo's mogelijk niet meer dan 20 nanograms totaal morpho per injectie tolereren. Injecteer de embryo's op dezelfde wijze als voorheen.

Houd de injectievolumes constant tussen de experimentele en controlegroepen, waarbij sets moeten worden opgenomen die onder de dissectiemicroscoop met elk morpholino afzonderlijk zijn geïnjecteerd. Controleer de geïnjecteerde embryo's direct na de injectie en meerdere keren gedurende de dag; gebruik een transferpipet om dode of stervende embryo's te verwijderen. Aangezien deze de levensvatbaarheid van de overige embryo's kunnen in gevaar brengen, worden gesedeerde of geëuthanaseerde embryo's op elk gewenst moment met een transferpipet verplaatst.

Gebruik een verdiepte objectglas voor observatie. Voor fotografie. Gebruik indien nodig een fijne pincet om het chorion te verwijderen.

Stabiliseer het embryo in een druppel 3% methylcellulose. Screen de embryo's op een duidelijk fenotype dat uniek is voor de combinatie van morphino's, in tegenstelling tot een grotere penetrantie van het fenotype van enkelvoudige morphino's. Hier zijn verschillende wildtype-embryo's die zijn geïnjecteerd met morphino's op drempelwaarde. Voor gata5 is het typische fenotype cardio bifida of twee harten, omdat de progenitoren in de middellijn niet zijn gefuseerd.

Let op de GFP-positieve cardiomyocyten die door de pijlen worden aangewezen. Het fenotype voor zes morphines omvat misvormde harten die niet correct lussen. Deze embryo's ontwikkelen eveneens GFP-positieve cardiomyocyten.

De embryo's die echter zijn geïnjecteerd met een combinatie van zowel gata five als gata six morpho's, zoals hier getoond, vertonen een volledig verlies van cardiomyocytenontwikkeling. Dit wijst erop dat ofwel gata five ofwel gata six tot expressie moet komen om de ontwikkeling van cardiomyocyten mogelijk te maken. De twee genen zijn functioneel redundant voor de specificatie van cardiomyocyten.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eerst uw morpho's volledig te valideren en er zo zeker mogelijk van te zijn dat zij een werkelijke knockdown van het enkelvoudige doelgen representeren na deze procedure. Andere methoden, zoals het combineren van conditionele muis-nullallelen, kunnen worden uitgevoerd om aan te tonen dat dezelfde genen functioneren. Evenzo bij zoogdieren.

Na het bekijken van de video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u kunt bepalen of twee genen functioneel redundant zijn tijdens de embryogenese.