Vergelijkende In vivo Studie van gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

Het algemene doel van deze procedure is om het evolutionair geconserveerde vermogen van het heatshockproteïne GP96 te bestuderen om antigeenspecifieke CD8 T-celresponsen te bevorderen in de kikker Xenopus laevis. Dit wordt bereikt door eerst peritoneale leukocyten te oogsten via peritoneale lavage. De tweede stap van de procedure is het pulseren van de peritoneale leukocyten met tumorafgeleid GP96, dat minor- en tumorantigenen begeleidt, na incubatie en wasstappen.

Peritoneale leukocyten worden via intraperitoneale injectie adoptief overgedragen naar naïeve kikkers om deze kikkers te primen tegen tumor- of mineure histocompatibiliteitsantigenen. De derde stap van de procedure is om de geprimede kikkers te onderwerpen aan een huidtransplantatie of een tumoruitdaging en het begin van huidtransplantaterejectie of tumorverschijning te monitoren. De laatste stap van de procedure is het afnemen van perifeer bloed om de T-cellen te karakteriseren die betrokken zijn bij de huidrejectie en de antitumorrespons.

Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een significante versnelling van de afstoting van huidtransplantaten laten zien, evenals vertragingen in het verschijnen van tumoren bij GP 96-geprimde kikkers via respectievelijk de huidtransplantatie- en de tumorchallenge-assays. Hallo, ik ben Christina Koska uit het laboratorium van Dr. Jacque Robert van de afdeling Microbiologie en Immunologie van het University of Rochester Medical Center. Ik ben Tanya Cruz, ook uit het laboratorium van Dr. River.

Vandaag laten we u een procedure zien voor het primen van kloonkikkers door adoptieve overdracht van peritoneale leukocyten, gevolgd door huidtransplantaties en tumortransplantatie-assays. Daarnaast laten we u zien hoe u perifeer bloed van deze dieren afneemt. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de eigenschap van het hittestabiele eiwit GP 96 te bestuderen om antigeenspecifieke CD8+ T-cellen in Xenopus laevis te stimuleren, evenals om de betrokken celtypen te bestuderen.

Oké, laten we beginnen. De kikkers die in onze experimenten worden gebruikt, zijn isogenetische klonen uit onze kweekkolonie aan de University of Rochester. Om peritoneale leukocyten of pls uit te lokken voor oogst, gebruik een naald van 25 gauge en 5/8 inch om de geanestheseerde kikker intraperitoneaal te injecteren met een hitte-geïnactiveerd E. coli-preparaat. Drie dagen na de injectie worden de pls geoogst via intraperitoneale lavage.

Om deze procedure te starten, wordt de buik van de geanestheseerde kikker gedesinfecteerd met een kleine hoeveelheid 70%ethanol. Gebruik vervolgens een 18 gauge 1,5 naald om vijf milliliter steriele amfibieën-fosfaatgebufferde zoutoplossing, of een op kamertemperatuur voorverwarmde PBS, in de peritoneale holte te injecteren. Verwijder de naald en masseer de kikker voorzichtig gedurende een minuut om ervoor te zorgen dat de geïnjecteerde buffer zich mengt met de vloeistof in de lichaamsholte.

Steek vervolgens een nieuwe 18 gauge 1,5 naald zonder spuit in de buikholte van de kikker. Verzamel, terwijl u de bloedvaten vermijdt, de peritoneale vloeistof die via de achterkant van de naald in een schone conische buis van 50 milliliter druppelt. Zorg ervoor dat u na het oogsten van de pls zoveel mogelijk van het aanvankelijk geïnjecteerde volume terugwint.

Plaats de kikker in een bak met ondiep water totdat deze wakker is, waarna hij terug in zijn kooi kan worden geplaatst. Zodra de pls zijn geoogst, centrifugeert u 10 minuten bij 1000 RPM bij vier graden Celsius, verwijdert u het sup, natant en resus. Suspendeer de pls in koude A PBS.

Breng de RESUSPENDERDE cellen over naar een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter. Pulseer de cellen met GP 96. Voeg de juiste hoeveelheid GP 96 toe aan de cellen en meng door te pipetteren; incubeer gedurende één uur op ijs. Na één uur.

Centrifugeer de cellen bij 14.000 RPM gedurende één minuut. Verwijder het supernatant om eventueel ongebonden GP 96 te verwijderen. Voeg koude A PBS toe en resuspendeer.

Centrifugeer de PLS opnieuw. Was de S in totaal drie keer met koud A-P-B-S-A om er zeker van te zijn dat er na de laatste wasbeurt geen residu van G 96 overblijft. Resuspendeer de gepulseerde pls op een concentratie van 5 × 10⁵ pls per 300 µL PBS om de pls adoptief over te dragen naar naïeve LG six-recipiënten.

Injecteer 300 µL pulsed pls intraperitoneaal per dier. De kikkers moeten minstens drie dagen voor de experimenten met huidtransplantatie of tumoruitdaging, die hierna worden getoond, worden voorbehandeld. De huid voor transplantatie wordt verkregen van een onder narcose staande LG 15 donorkikker.

Gebruik een schaar om een klein stukje ventrale huid weg te snijden en te verwijderen; dit is de abdominale huid die er zilverachtig uitziet. Vanwege de aanwezigheid van ARI zijn vier gepigmenteerde cellen zichtbaar tijdens het hanteren van het transplantaat. Het is essentieel om het weefsel zo min mogelijk te manipuleren, aangezien dit tot schade aan het transplantaat kan leiden.

Houd de huid zeer voorzichtig vast met de pincet en plaats deze in een petrischaal met koude A PBS. Houd de petrischaal op ijs. Plaats de huid op een schoon objectglas en gebruik een scheermes om individuele grafts in stukjes van vijf millimeter bij vijf millimeter te snijden.

Bewaar de fragmenten in PBS op ijs om de huid op de LG six ontvangerkikker te enten. Maak eerst een kleine incisie in de dorsale huid van de geanestheseerde ontvanger. Plaats vervolgens het graft van vijf millimeter bij vijf millimeter onder de huid met de zilverachtige zijde naar boven.

Let erop dat de markeringen van de schaar en de pincet op de transplantaten worden genoteerd, aangezien deze niet als afstoting van het transplantaat worden geteld. Zodra de scoring 24 uur later begint, moet een deel van de bovenliggende huid van de gastheer van het transplantaat worden verwijderd. Gebruik een schaar om een venster rond het transplantaat uit te snijden, zodat het transplantaat vrij zichtbaar is.

Zorg ervoor dat u de donorhuid niet aanraakt of bloedingen veroorzaakt. Begin onmiddellijk met het markeren van het transplantaat door een schets te maken. Huidtransplantaat.

Afstoting wordt bepaald door het percentage destructie van het aridol op de getransplanteerde huid. De graft moet elke twee tot drie dagen onder de stereomicroscoop worden gecontroleerd. Bereid de tumorcellen voor op transplantatie door ze te resuspenderen in tumorcelmedium met een dichtheid van vijf keer 10⁵ cellen per 300 µL.

Transplanteer de cellen via een subcutane injectie aan één zijde van de dorsale zijde van het dier. Per kikker wordt 5 × 10⁵ cellen in een volume van 300 µL geïnjecteerd. De tumorgroei zal binnen twee tot drie weken na de tumorchallenge beginnen.

Noteer het initiële uiterlijk van de tumor. Gebruik een schuifmaat om de afmetingen van de tumor te meten en registreer het volume elke twee tot drie dagen voorafgaand aan de afname van blodleukocyten van de kikker. Bereid glazen naalden voor door pasta peppes over een vlam te trekken.

Nadat het fijne uiteinde van de pipet onder de stereomicroscoop is verscherpt, sluit u de pipet aan op een plastic aspiratieslang. Om te beginnen met de bloedafname, snijdt u de huid boven de achterpoot van de geanestheseerde kikker open om de vena tarsalis dorsalis bloot te leggen. Vul de glazen naald met één tot twee milliliters ijskoude PBS plus heparine-oplossing.

Steek vervolgens de glazen naald in de ader en begin met het afnemen van bloed door langzaam met de mond te aspireren. Van een gemiddeld grote kikker kan één tot twee milliliter bloed worden verkregen. De kleine incisie in het poot van de kikker hoeft niet te worden gehecht.

De wond zal binnen een week genezen. Hier worden de resultaten getoond van een stereomicroscopische analyse van huidtransplantaatafstoting 12 dagen na transplantatie. Een LG six gekloonde kikker die een huidtransplantaat ontving van een MHC-identieke LG six donor vertoonde geen afstoting.

Het asterisk geeft marker-pincetten aan die niet duiden op afstoting. In tegenstelling hiermee vertoont een LG six gekloonde kikker die een huidtransplantatie ontving van een MHC-disparate outbred donor 80% afstoting. In beide afbeeldingen geven pijlen zilverkleurige iridofoor-pigmentcellen aan die gezond, niet-afgestoten getransplanteerd weefsel markeren.

In dit volgende experiment werden LG 15-leukocyten gepulst met ofwel PBS als negatieve controle, recombinant GP 96 gezuiverd uit een e. coli-cultuur, of GP 96 gezuiverd uit 15-nul tumorweefselcellen. Deze werden vervolgens adoptief overgedragen aan volwassen LG 15-recipients en drie dagen later werden levende 15-nul tumorcellen via subcutane injectie getransplanteerd. Tumoren die voor het eerst verschenen na de challenge werden gemonitord en de tumorgrootte werd periodiek gemeten. In deze grafieken vertegenwoordigt elke curve de kinetiek van de tumorgroei in één kikker. De resultaten tonen aan dat dieren die waren geprimd met 0,5 of 1 µg GP 96 een significant vertraagde tumorverschijning vertoonden in vergelijking met de controlegroepen. Daarom faciliteert GP 96 de cross-presentatie van tumorantigenen in Xenopus.

We hebben zojuist aangetoond hoe de capaciteit van GP 96 om zowel minderheids- als tumorantigenen te presenteren in de kikker xap lavis kan worden onderzocht via huidtransplantaties en tumortransplantatie-assays. Tijdens deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat peritoneale lavage moet worden vermeden als er een bloedvat is beschadigd, aangezien de meerderheid van de cellen dan erytrocyten en geen macrofagen zijn. Het is daarnaast belangrijk om het weefsel niet met de pincet samen te knijpen bij het manipuleren van de huidtransplantatie om beschadiging te voorkomen.

Dat is alles. Bedankt voor het wassen en veel succes met uw experimenten.