Experimentele modellen voor Studie van het retinale pigmentepitheel fysiologie en pathofysiologie

Het hoofddoel van deze procedure is het genereren van culturen van menselijk foetaal retinaal pigmentepitheel, of RPE, die als model kunnen worden gebruikt. Bij onderzoek naar menselijke oogziekten worden weefsels van donoren ontvangen in de vorm van intacte oogbollen. De eerste stap van de procedure is het wegsnijden van overtollig spier- en bindweefsel, om vervolgens het oog te openen door het hoornvlies en de lens te verwijderen.

Het oog wordt behandeld met dispa en platgedrukt, waarna de RPE-monolaag van het vaatvlies wordt gepeld. De gedissecteerde RPE-cellen worden in flessen gezaaid en gedurende enkele weken gekweekt tot ze confluente monolagen vormen en pigment ontwikkelen. De celculturen worden gebruikt in in vitro functionele experimenten.

Succesvolle in vitro-experimenten worden herhaald in preklinische diermodellen, waarbij RPE-responsen beter kunnen worden geëvalueerd in complexere signaleringsomgevingen. Het hier gedemonstreerde model zal leiden tot een beter begrip van de RPE-fysiologie en nieuwe therapeutische interventies voor de behandeling van oogziekten. Hallo, mijn naam is Sheldon Miller.

Mijn laboratorium bevindt zich in het National Eye Institute, dat deel uitmaakt van de National Institutes of Health op de campus van Bethesda, Maryland. Hallo, ik ben Arki van het Miller Lab. Vandaag laten we u een procedure zien voor het voorbereiden van primaire culturen van menselijke foetale retinale pigmentepitheelcellen.

Deze cellen worden geprepareerd als confluente monolagen die kunnen worden gemonteerd in gemodificeerde sing chambers. We zullen deze geïsoleerde menselijke RPE-cellen ook gebruiken voor biochemische en genetische studies. We passen deze procedure in ons laboratorium toe om primaire culturen van epitheelcellen op te zetten om de functie en regulatie van fysiologische en pathofysiologische processen te bestuderen en klinische diermodellen voor ziekten te ontwikkelen.

We richten ons op het retinaal pigmentepitheel of RPE, dat zich aan de achterzijde van het oog bevindt en de neurale retina scheidt van de bloedvoorziening van het choroidea. Dit schematische diagram van het oog toont de locatie van de RPE-laag aan de achterzijde van het oog, direct grenzend aan de fotoreceptoren. De inzet toont de cellen van de retina, met de fotoreceptoren aan de rechterkant en de ganglioncellen aan de linkerkant.

Dit epitheel is metabolisch extreem actief. Het fagocyteert voortdurend fotoreceptoren op dagelijkse basis, en het slaat vitamine A, het visuele pigment, op, transporteert en verspreidt dit naar de fotoreceptoren. In de visuele cyclus werkt het homeostatisch om de chemische samenstelling en het volume van de omliggende extracellulaire ruimtes te handhaven.

Een cruciale eigenschap van epitheel is de polariteit. De voortdurende asymmetrische levering van eiwitten naar de apicale en basolaterale membranen is een gereguleerd proces dat het epitheel in staat stelt om het vectoriële transport van metabolieten, ionen en vloeistof van de ene extracellulaire ruimte naar de andere te bewerkstelligen. Deze activiteit helpt het epitheel om de gezondheid en integriteit van het neurale retina te behouden.

De in vitro preparatie die we hier beschrijven, maakt het mogelijk om transporteiwitten, receptoren en signaleringspaden te analyseren die de epitheliale polariteit en functie bepalen voordat de dissectie begint. Bereid een 12-wells plaat voor in een laminaire flowkast met oplossingen op kamertemperatuur. Voor elk oog is één well met 10 x antibioticum-antimycoticumoplossing nodig, twee wells met 1x PBS en één well met twee eenheden per milliliter disc space verdund in 5% RPE-medium met serum. Vul een met siliconen gevoerde dissectieschaal met 1x HBSS, giet de vloeistof af en breng elk oog over naar één well met antibioticum-antimycoticumoplossing.

Incubeer drie tot vijf minuten bij kamertemperatuur. Vermijd het uitoefenen van overmatige druk op de oogbol. Spoel het oog in twee opeenvolgende wells met XPBS om overtollig antibioticum te verwijderen.

Gebruik vervolgens een pincet om het oog onder een dissectiestereomicroscoop over te brengen naar de dissectieschaal gevuld met één X-H-B-S-S. Gebruik irisscharen om overtollig spier- en bindweefsel rondom het oog te verwijderen. Positioneer het oog zodanig dat het hoornvlies naar boven is gericht.

Gebruik twee steriele naalden van 27 gauge om het oog via het bindweefsel aan het siliconen kussen vast te pinnen zonder de sclera te beschadigen. Maak in deze positie met een zijpoortsmes een incisie door de sclera. De snede moet zich op een derde van de afstand tussen de equatoriaallijn van het oog en het voorvlak bevinden.

Gebruik irisscharen om de incisie cirkelvormig rond het oog voort te zetten om beschadiging van het retinaal pigmentepitheel, afgekort RPE, door tractie van het glasachtig lichaam op de retina te voorkomen. Gebruik dezelfde scharen om door het glasachtig lichaam te knippen om de voorste oogflap van de oogkom te scheiden.

Til het anterieure gedeelte van de IOA op en gooi dit weg. Gebruik een pincet om het geopende oog over te brengen naar de well met dys. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de oogcup zitten.

Incubeer gedurende 40 tot 60 minuten bij 37 °C met 5% CO₂. Verplaats het oog vanuit de disruんte-ruimte terug naar de dissectieschaal, die is gevuld met verse 1X HBSS op kamertemperatuur. Positioneer het oog met de cup naar boven en zet het vast met twee naalden van 27 gauge.

Til het gedeeltelijk gescheiden netvlies onder de dissectiemicroscoop voorzichtig op met een fijne pincet en een retinaschaar. Knip het netvlies los van de oogzenuw. Verwijder het netvlies met de irisschaar.

Maak een incisie vanaf de periferie van het oog naar de oogzenuw. Zet het oog vast met 5 naalden van gauge 27. Om de RPE-laag uit te rekken, gebruikt u retinascharen om een cirkelvormige snede rond de oogzenuw te maken.

Scheid de RPE-laag door over te schakelen naar een vergroting van 250x of meer. Zoek de rand van het RPE-vel langs de snede die met de irisschaar is gemaakt en dicht bij de oogzenuw. Gebruik twee paren pincetten om het RPE en het Bruchs-membraan van de choroidea-weefsellaag te scheiden.

Probeer verschillende plaatsen langs de gesneden rand om te bepalen waar de verbinding tussen het RPE en het choroidea het zwakst is. Pel het membraan voorzichtig af om het volledig te verwijderen. Plaats de RPE-vellen in een conische buis van 15 milliliter gevuld met trips in EDTA op kamertemperatuur.

Wanneer alle vellen zijn verzameld, sluit u de buis af en incubeert u de buizen 10 minuten in een waterbad bij 37 °C. Schud de buis krachtig om het RPE in kleine clusters te scheiden. De afwezigheid van donkere celklompen geeft aan dat de scheiding voltooid is.

Plaats de buis nog eens vijf minuten terug in het waterbad. Gebruik een Pasteurpipet en voorzichtig opzuigen om alle onverteerde weefselresten te verwijderen. Centrifugeer de cellen gedurende vier minuten bij 280 5G.

Verwijder het supernatant. Vul het uiteindelijke volume aan tot negen milliliter met 15% RPE-medium en pipetteer om te resuspenderen. Pipetteer drie milliliter van de celsuspensie in een kolf van 25 vierkante centimeter.

Voeg twee milliliters vers, op kamertemperatuur gebracht, 15% RPE-kweekmedium toe. Incubeer de cellen gedurende de nacht bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. Naarmate de kweken rijpen, zal hun pigmentatie na drie tot vier weken toenemen.

Succesvolle culturen zullen confluent zijn en een uniforme, intense pigmentatie vertonen. We hebben u zojuist laten zien hoe u primaire culturen van menselijk foetaal RP bereidt. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.