Visualisatie en kwantificering van intracellulaire interacties van Neisseria meningitidis En Human α-actinine door Confocale Imaging

Het algemene doel van het volgende experiment is het beoordelen van de mate van colocalisatie van geïnternaliseerde bacteriën, RIA Meningitidis, met het cytoskeletproteïne Alpha Actinin. Dit wordt bereikt door gekweekte menselijke hersenmicrovasculaire cellen gedurende drie tot acht uur te infecteren met een overnachtkweek van bacteriën, zodat de bacteriën de doelcellen kunnen binnendringen. In een tweede stap worden de cellen met intracellulaire bacteriën gewassen, gefixeerd en vervolgens gepermeabiliseerd, waardoor de geïnfecteerde kweek wordt klaargemaakt voor immunokleuring van de geïnternaliseerde bacteriën en het intracellulaire alpha actinin.

Na de confocale beeldvorming en de toepassing van colocalisatiesoftware kunnen beelden van de intracellulaire colocalisatie worden waargenomen en worden gekwantificeerde resultaten verkregen waaruit blijkt dat Meninga Croci-expresserende OPC en ook membraaneiwitten specifiek kunnen interageren met intracellulair alpha-actinine, op basis van confocale microscopische visualisatie en kwantitatieve colocalisatieanalyse. Hallo, ik ben Isel Maria van het laboratorium van professor Mata TI bij de afdeling Cellulaire Moleculaire Geneeskunde aan de Universiteit van Bri. Vandaag laten we u een procedure zien voor het schatten van het colocalisatieniveau, de ratio van intracellulaire bacteriën met cytoskeletproteïnen.

Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de interactie tussen mycelium meningitis dat een auto membraaneiwit OPC tot expressie brengt en het cytoskelet-eiwit alfa actin te bestuderen. Laten we beginnen. Dit werk moet worden uitgevoerd in een adequaat veiligheidslaboratorium.

Inoculeer twee dagen vóór de immunokleuringsprocedure de gewenste bacteriële stam op brain heart infusion-agarplaten, aangevuld met 10% verhit paardenbloed. Laat deze platen de dag vóór de immunokleuring gedurende de nacht groeien bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO2. Gebruik een entlus van 10 µL om een suspensie te maken van de overnight bacteriële cultuur.

Laat de suspensie in twee milliliter PBSB vijf minuten bij kamertemperatuur staan zodat grote bacteriële aggregaten kunnen bezinken. Draag vervolgens de bovenste ene milliliter van de suspensie over naar een steriele buis zonder het pellet te verstoren. Solubiliseer de bacteriën door ene milliliter 1% SDS 0,1 molar natriumhydroxide toe te voegen aan twee vials die 20 microliters bacteriële suspensie bevatten en keer de buis om om te mengen. Om de bacteriële aantallen te schatten.

Meet het nucleïnezuurgehalte door de absorbentie van de oplossing te bepalen. Stel de bacteriële suspensie bij 216 aan om de vereiste dichtheid in het infectiemedium te verkrijgen voor het infecteren van de humane hersenmicrovasculaire endotheelcellen. Plaats, twee dagen voorafgaand aan de immunokleuring, glazen dekglasjes van 16 millimeter in de wells van een 12-wells plaat en zaai humane hersenmicrovasculaire endotheelcellen (H-B-M-E-C-A) uit op de dekglasjes tot 50% confluentie; incubeer deze overnacht bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO2 tot de volgende dag.

Infecteer de cellen met de vers bereide bacteriële suspensie in ons laboratorium. Er wordt routinematig gebruikgemaakt van een infectieratio van 200 tot 300 colony forming units per doelcel. Incubeer gedurende drie tot acht uur bij 37 °C in 5% CO2 aan het einde van de infectieperiode.

Was de cellen drie keer met PBS en fixeer deze met 500 microliters 2% paraformaldehyde gedurende 30 tot 45 minuten bij kamertemperatuur. Na het uitwassen van het paraformaldehyde worden de met paraformaldehyde gefixeerde cellen gepermeabiliseerd door incubatie in 0,1% Triton X 100 verdund in PBS gedurende 10 minuten. Was de monsters tot slot drie keer met PBS en ga over tot de immunokleuring zoals beschreven. Vervolgens kunnen de kleuring van intracellulaire bacteriën en voor actinine gelijktijdig worden uitgevoerd.

Blokkeer in 12-wells platen de dekglasjes met de permeabiliseerde cellen met 500 µL 3% B-S-A-P-B-S-T gedurende 30 tot 60 minuten. Na het wassen met PBS bij kamertemperatuur wordt elk dekglasje overgebracht naar een nieuwe droge well in de 12-wells plaat. Voeg gelijktijdig de primaire antilichamen tegen bacteriën en alfa-actinine toe; 80 tot 100 µL antilichaam per dekglasje is voldoende indien dit voorzichtig wordt toegevoegd om het oppervlak van het dekglasje te bedekken. Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur. Voeg aan het einde van de incubatie 200 µL PBS toe aan de well, til het dekglasje op en plaats het in een nieuwe well met 500 µL PBS. Verwijder na vijf minuten de PBS met een pipet en voeg vervolgens verse PBS toe. Herhaal dit tweemaal en breng de dekglasjes over naar een nieuwe droge well.

Voeg vervolgens de passende secundaire antilichamen toe, geconjugeerd aan verschillende fluorochromen en verdund in 1% B-S-A-P-B-S-T. Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur in het donker. Aan het einde van de incubatie wordt er gewassen zoals eerder beschreven. Kleur daarna het DNA tegen met DPI gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur in het donker. Was aan het einde van deze incubatie de dekglasjes één keer in PBS en monteer ze vervolgens met een druppel monteermedium. De gemonteerde dekglasjes moeten in het donker worden bewaard totdat ze klaar zijn voor observatie. Onder de microscoop observeren en leggen we beelden vast van onze immunogelabelde monsters met behulp van een confocale laser-scanning microscoop gekoppeld aan een geïnverteerde epifluorescentiemicroscoop.

Om te beginnen met de CLSM-procedure, breng een druppel immersievloeistof aan op het objectief, plaats het preparaatglas op de microscooptafel, zet de microscoop in de visuele modus en zoek het gebied van belang via de oculairs van de microscoop; we kunnen nu de Leica-software gebruiken. Selecteer de XYz-acquisitiemodus. Selecteer het 512 bij 512-formaat voor colocalisatiestudies.

Hoe hoger de resolutie, hoe nauwkeuriger het beeld. Selecteer vervolgens de bidirectionele X-modus, wat de scansnelheid verhoogt en helpt bij het verminderen van fotobleken. Stel de instellingen voor sequentiële scanning in.

Klik op de SEC-functie en selecteer vervolgens tussen de lijnen. Selecteer de laserstralen op basis van de fluorochromen die gekoppeld zijn aan de secundaire antilichamen. 405 nanometers voor DPI, 488 nanometers voor Alexa Fluor 488 en 561 nanometers.

Activeer voor trixy respectievelijk fotomultiplicatorebuis één, twee en drie. Stel de boven- en onderkant van de Z-stapel of -reeks in. Stel vervolgens de Z-stapgrootte in op 0.2 micrometers.

RIA Mencius is een diplococcus en aangezien elke coccus een benaderde diameter heeft van 0.5 micrometers, vergroot een Z-stapgrootte van 0.2 micrometers de kans dat elke coccus ten minste twee keer wordt gescand. Stel de uiteindelijke scanparameters in door een lijnmiddeling van drie te selecteren om de signaal-ruisverhouding te verbeteren en klik vervolgens op start. Dubbel- of drievoudig gekleurde beelden worden verkregen door sequentiële scanning bij verschillende golflengten en door de 'between lines'-modus voor elk kanaal te gebruiken om crosstalk tussen de verschillende chromoforen te elimineren.

Voor een indicatie van colocalisatie van twee fluorochromen selecteert u de overlay-functie om geselecteerde kanalen samen te voegen tot één enkel beeld. Wanneer bijvoorbeeld zowel Alexa 488 als trissy Fluor Chromes colocaliseren, verschijnt er een gele kleur in het overlay-beeld. Voor een 2D-reconstructie die nodig is voor het visualiseren van mogelijke colocalisatie, stelt u een Z-stack of serie samen met behulp van de maximumprojectiefunctie. Verwerk na het verkrijgen van de Z-stack of serie uw gegevens om een orthogonaal beeld te verkrijgen voor de visualisatie van de intracellulaire lokalisatie van diverse elementen.

De kwantificering van colocalisatie wordt uitgevoerd met de Vol City-software van IMP provision. Maak eerst een bibliotheek aan met CLSM-beelden en selecteer 'extended focus' bij het beeld in de bovenbalk. Deze tool combineert z-stacks in een 2D-beeld dat geanalyseerd kan worden.

Select nu de COLOCALISATIE-tool. De twee te analyseren kanalen moeten dezelfde kleurdiepte hebben. Selecteer het gebied dat gekwantificeerd zal worden.

Stel de drempelwaarde in om eventuele achtergrondruis te verwijderen. Genereer de colocalisatie-output door te selecteren op 'generate colocalization'. Colocalisatiestatistieken worden gegenereerd voor de eerder geselecteerde regio's van interesse.

Select vervolgens de Mander-coëfficiënten R en ny. Exporteer ten slotte de statistische waarden naar een Excel-document voor de datapresentatie; hier worden representatieve resultaten van confocale beeldvorming getoond van menselijke cerebrale endotheelcellen die acht uur lang zijn geïnfecteerd met Neisseria meningitidis. De locatie van de bacteriën is in het rood weergegeven.

Terwijl de locatie van alpha actinin wordt getoond, geven groene pijlen regio's aan waar een hoge mate van alpha actinin-accumulatie lijkt te zijn opgetreden rond bacteriën. In deze overlay-afbeelding zijn er verschillende regio's waarin een geel-oranje kleur verschijnt, wat wijst op colocalisatie tussen meninga occi en alpha actinin. In de volgende afbeelding geeft optische dissectie van een geïnfecteerde H-B-M-E-C-monolaag colocalisatie aan rond intracellulaire bacteriën die zich aan de basis van een cel bevinden.

Wanneer driedimensionale beelden van geïnfecteerde H-B-M-E-C-monolagen werden verwerkt, toont een schuin aanzicht van het apicale oppervlak een rood gekleurde Durant-bacterie, aangegeven door de rode pijl, terwijl verschillende bacteriën zich naar de basale oppervlakken van de endotheelcellen bevinden, aangegeven door de gele pijl. Een duidelijk oranje-gele basale lokalisatie is helderder te zien in deze endon XZ-dwarsdoorsnede. In tegenstelling tot afar, actinine-experimenten waarbij labeling van geïnternaliseerde bacteriën en ofwel menton of actine werd uitgevoerd, onthullen incidentele colocalisatie met actine, maar zeldzame colocalisatie met fermenterend in H-B-M-E-C-cellen.

Zoals waargenomen in de vorige experimenten, was Retin geconcentreerd rond verschillende geïnternaliseerde bacteriën, aangegeven door de witte pijlen. De gegevens werden ook geanalyseerd om de relatieve overlap te bepalen. Coëfficiënt R, die volgens Manda de werkelijke graad van colocalisatie vertegenwoordigt, oftewel het aantal pixels dat colocaliseert vergeleken met het totale aantal pixels en NY-waarden voor alpha-actinine, menting en actine in het algemeen in H-B-M-E-C geïnfecteerd met OPC-expresserende meningokokken, resulteerde in een overlap van meer dan 25% van rein in een meningokok.

De coëfficiënt Y is een maat voor de frequentie waarmee het meer voorkomende rein-signaal optreedt telkens wanneer het minder voorkomende meninga cocoa-signaal voorkomt. Deze maat vertoont een opvallende mate van aanwezigheid van alpha actinin in de nabijheid van geïnternaliseerde meninga cockeye. We laten u zien hoe u de co-lokalisatie van geïnternaliseerde bacteriën met cytoskeletelementen binnen dit experiment kunt visualiseren en kwantificeren.

Het is belangrijk om te onthouden dat de protocollen voor fixatie en immunokleuring strikt moeten worden gevolgd om de integriteit van de structuren te behouden en een hoge achtergrondruis te voorkomen. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.