Targeting van Deep Brain Structuren met micro-injecties voor de levering van drugs, virale vectoren, of Cell Transplantaties
1 december 2010
In dit artikel tonen we een methode om glazen capillaire naalden te maken met een 50-um lumen. Deze techniek vermindert de schade aan de hersenen, minimaliseert passieve diffusie van geneesmiddelen en maakt een nauwkeurige targeting naar de knaagdieren hersenen.
Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van uiterst precieze micro-injecties in diepe hersenstructuren voor het toedienen van geneesmiddelen, virale vectoren of celtransplantaten. Dit wordt bereikt door eerst glazen capillaire naalden te produceren met een lumen van 50 micrometer. De tweede stap van de procedure is het vullen van 50% van de naald met minerale olie via capillaire werking en het inbrengen van de zuiger via het breedste uiteinde van de buis.
De derde stap van de procedure is het vullen van de naald met de stof of de celсусpensie die geïnjecteerd moet worden. De laatste stap van de procedure is het inbrengen van de naaldpunt en het injecteren van de stof met een zeer lage stroomsnelheid in een diepe hersenstructuur. Hiermee kunnen uiteindelijk resultaten worden behaald die een zeer nauwkeurige targeting van stoffen in de hersenen aantonen via micro-injecties met een glazen capillaire buis.
Hallo, ik ben Oscar Gonzalez van het Laboratorium voor Neurowetenschappen aan de School voor Psychologie van de Universiteit van Colima, Mexico. Vandaag laten we u een procedure zien voor het uitvoeren van micro-injecties met een glazen capillaire buis om medicijnen in de hersenen van muizen toe te dienen. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om volwassen neurale stamcellen te bestuderen.
Laten we beginnen. Het gebruik van glazen capillaire naalden met een lumen van 50 micrometer voor micro-injecties in de hersenen vermindert hersenschade aanzienlijk, minimaliseert de passieve diffusie van geneesmiddelen en maakt nauwkeurige targeting in de hersenen van knaagdieren mogelijk. Voordat micro-injecties kunnen worden uitgevoerd, moeten de glazen naalden worden vervaardigd.
Begin met het plaatsen van de capillaire glazen buis in een trek-elektrode met hoge weerstand van een micropipet-trekker. Zet vervolgens de elektrode van de micropipet-trekker aan. Om het midden van de glazen buis te verhitten en het glas daar lokaal te verzachten, wordt de glazen buis langs zijn longitudinale as over een initiële afstand van drie tot vijf millimeter uitgerekt, wat voldoende is om een vermindering van de diameter van de glazen buis in het gelokaliseerde gebied te veroorzaken.
Blijf de glazen buis uitrekken tot deze breekt. Herhaal deze stappen om twee identieke naalden met één lumen te maken. Plaats de glazen naalden vervolgens in een micro-smedeofen.
Een hoek van 30 graden is voldoende om de punt af te schuinen. Plaats de naalden tot slot onder de microscoop en controleer of ze beide de juiste binnendiameter hebben. Voor de meeste hydrofiele geneesmiddelen is een binnendiameter van 30 tot 50 micrometer ideaal voor de vervaardigde naalden.
Laten we bekijken hoe deze voor micro-injecties kunnen worden gebruikt. Vul eerst de vervaardigde naald vanaf het breedste uiteinde met minerale olie. Laat de minerale olie door capillaire werking binnenstromen totdat deze ongeveer 50% van de lengte van de capillaire buis heeft bereikt.
Breng vacuümvet aan rond het breedste uiteinde van de naald en voeg de zuiger hierdoor in. Duw de minerale olie voorzichtig weg totdat er een kleine druppel uit de punt van de glazen naald komt. Zet de naald vervolgens vast in de houder van de micro-injector en begin met het voorbereiden van het dier voor de injectie.
Plaats eerst een warmtemat op de stereotactische dierenhouder om de lichaamstemperatuur van het dier op peil te houden. Houd deze op 37 °C, scheer het hoofd van de gesedeerde muis en plaats deze vervolgens in het stereotactische apparaat om het dier te fixeren. Gebruik oorstaven en een tandhouder en maak met een chirurgisch mesje een incisie in de huid van de oren tot aan de Lambda-schedellijn.
Polijst de schedel met een wattenstaafje om deze te drogen en trek de huid uit het operatieveld. Gebruik vervolgens de punt van de glazen naald om de vertex van de bgma-naad aan te wijzen en stel daar de initiële injectiepositie in. Bepaal nu het punt op de schedel dat geboord moet worden door de x- en y-as van het stereotactische apparaat over de schedel te bewegen.
Boor met een onderzoeksmicroboor voorzichtig gaten op de geselecteerde coördinaten met behulp van fijne pincetten. Verwijder voorzichtig de diepste botlaag en doorprik het dura mater-membraan. U zult zien dat er wat hersenruggenvloeistof naar buiten lekt.
Om te bevestigen dat de naald door de geboorde gaten kan gaan, laat u de glazen naald langzaam zakken met behulp van de Z-as van het stereotactische apparaat. Pipetteer nu één µL van het te injecteren geneesmiddel en plaats dit op een klein stukje Parafilm. Plaats de Parafilm op de schedel.
Zuig het geneesmiddel op door aan het wiel van de micro-injector te draaien, terwijl u via de microscoop controleert of de vloeistof in de glazen naald stijgt. Verwijder de parafilm en zet de nulcoördinaat opnieuw in. Verplaats de naald nu naar de geselecteerde coördinaten en laat de houder zakken totdat de punt van de glazen naald voorzichtig het breinoppervlak raakt, en stel de Z-coördinaat in op nul.
Breng de glazen naald in het hersenparenchym in tot de gewenste diepte. Injecteer het middel langzaam met een snelheid van ongeveer één nanoliter per seconde. Wanneer het gewenste volume is geïnjecteerd, laat u het middel gedurende twee minuten diffunderen in het parenchym, om vervolgens de naald rustig en langzaam te verwijderen.
Lijm tot slot de chirurgische wond dicht en haal het dier uit het stereotactische apparaat. Plaats het dier in een voorverwarmde kooi voor het herstel van de anesthesie. We laten nu enkele resultaten van de microinjectie zien.
Lysofosfatidylcholine of lyin werd in het corpus callosum geïnjecteerd om demyelinisatie van de witte stofbanen te produceren en het hersenletsel door de glazen naald te minimaliseren. Er werd slechts 20 liters lyin geïnjecteerd. Demyelinisatie wordt aangetoond door de afwezigheid van expressie van myelin basic protein in de witte stofbanen; door een zeer precieze injectie en een zeer dunne naaldbaan wordt het hersenletsel tot een minimum beperkt.
We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u glazen naalden vervaardigt voor het uitvoeren van micro-injecties in diepe hersenstructuren. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat alle apparatuur en materialen klaarstaan voor gebruik in de operatiekamer. Dat is alles.
Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presente করে een methode voor het maken van glazen capillaire naalden met een lumen van 50-μm, waardoor nauwkeurige micro-injecties in diepe hersenstructuren mogelijk zijn. Deze techniek minimaliseert hersenschade en vermindert de passieve diffusie van geneesmiddelen, wat gerichte toediening in knaagdiermodellen mogelijk maakt.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Microinjectietechnieken
- Drug Delivery-systemen
Achtergrond
- Micro-injecties zijn essentieel voor het direct afleveren van stoffen in de hersenen.
- Traditionele methoden kunnen aanzienlijke hersenschade en een inefficiënte toediening van geneesmiddelen veroorzaken.
- Glazen capillaire naalden bieden een oplossing voor nauwkeurige targeting.
- Deze studie richt zich op het verbeteren van het micro-injectieproces.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor het maken van glazen capillaire naalden met een lumen van 50-µm.
- Het verbeteren van de precisie bij de toediening van geneesmiddelen in diepe hersenstructuren.
- Het minimaliseren van hersenschade tijdens het injectieproces.
Gebruikte methoden
- Productie van glazen capillaire naalden met een lumen van 50 µm.
- Vullen van de naald met minerale olie om de injectie te vergemakkelijken.
- Laden van de naald met de gewenste stof of cel-suspensie.
- Injecteren van de stof bij een lage stroomsnelheid in doelsecties van de hersenen.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt een nauwkeurige targeting van stoffen in de hersenen mogelijk.
- Aanzienlijke vermindering van hersenschade in vergelijking met traditionele methoden.
- Efficiënte toediening van geneesmiddelen, virale vectoren of celtransplantaten.
- Aantoonbare effectiviteit in knaagdiermodellen.
Conclusies
- De ontwikkelde techniek verbetert de precisie van micro-injecties.
- Het biedt een betrouwbare methode voor medicijntoediening in neurowetenschappelijk onderzoek.
- Deze aanpak kan worden toegepast op diverse stoffen, waardoor de experimentele resultaten worden verbeterd.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
De nauwkeurige toediening van therapeutische middelen aan diepe hersenstructuren blijft een kritische uitdaging bij de ontwikkeling van geneesmiddelen in de neurowetenschappen, vooral bij kleine diermodellen waarbij procedurele trauma's de resultaten kunnen beïnvloeden. Deze micro-injectiemethode verbetert de precisie van de target-interactie door injectie-geïnduceerde weefselschade en passieve diffusie te minimaliseren, waardoor de betrouwbaarheid van farmacologische en genetische interventiestudies wordt vergroot. Deze aanpak ondersteunt het mechanistische risicobeheer in de vroege ontdekkingsfase door reproduceerbare toediening van kleine volumes geneesmiddelen, virale vectoren of celtransplantaties met verminderde biologische variabiliteit mogelijk te maken.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt nauwkeurige toetsing van therapeutische hypothesen in diepe hersenkernen mogelijk door off-target effecten door injectietrauma te verminderen.
- Operationele waarde: Ondersteunt een consistente toediening van verbindingen of genetische instrumenten over verschillende studies heen, waardoor de reproduceerbaarheid in workflows voor targetvalidatie wordt verbeterd.
- Voorspellend vertrouwen: Minimaliseert procedurele variabiliteit die werkelijke farmacologische of biologische responsen zou kunnen maskeren.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor met een minimale laesiebelasting voor downstream compound-screening in CZS-routes.
- Operationele waarde: Maakt gestandaardiseerde, laag-volumineuze (20–100 nl) injecties mogelijk die geschikt zijn voor precisie-assayformaten die een strikte farmacokinetische controle vereisen.
- Hergebruik van het platform: Aanpasbaar aan verschillende stoffen (geneesmiddelen, virale vectoren, cellen) door de lumengrootte van de naald aan te passen, wat multi-modale screeningcampagnes ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de getrouwheid van ziektemodellen door storende letsels als gevolg van injectieprocedures te verminderen, wat de translationele relevantie verbetert.
- Operationele waarde: Faciliteert reproduceerbare interventies in longitudinale studies, wat chronische doseringsschema's of celtransplantatieregimes ondersteunt.
- Risicogestuurde vooruitgang: Verbetert het vertrouwen in data over target engagement, wat helpt bij go/no-go-beslissingen in preklinische programma's.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot lead-optimalisatie, waarbij een nauwkeurige toediening aan het centraal zenuwstelsel essentieel is voor het beoordelen van targetmodulatie en pathway-engagement.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing in diepe hersenstructuren door nauwkeurige afgifte van farmacologische of genetische probes mogelijk te maken.
- Screening: Maakt kwantitatieve, reproduceerbare dosering mogelijk voor de in vivo evaluatie van verbindingen, wat essentieel is voor dosis-responsstudies en studies naar targetbezetting.
- Analytics: Genereert zuivere resultaten door procedure-geïnduceerde ruis te minimaliseren, waardoor de signaaldetectie bij biomarker- of effectiviteitsmetingen wordt verbeterd.
- Translationeel Onderzoek: Bevordert de continuïteit van discovery naar preklinische fasen door een consistente afgifte met minimaal trauma in alle studiefasen te waarborgen.
- Enterprise Hergebruik: Vertegenwoordigt een gestandaardiseerde, aanpasbare capaciteit voor CNS-afgifte die toepasbaar is op meerdere projecten en modaliteiten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit door injectieartefacten te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie tussen laboratoria en studies via gedefinieerde naaldvoorbereiding en injectieparameters.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door het aantal mislukte studies als gevolg van procedurele variabiliteit of off-target effecten te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt een betrouwbaardere prioritering van CNS-targets mogelijk op basis van zuiverdere farmacologische en genetische gegevens.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microschirurgie, stereotactische coördinatie en het vervaardigen van naalden met een pipette-puller en micro-smeder.
- Is afhankelijk van toegang tot gespecialiseerde instrumentatie, waaronder een stereotactisch frame, een micro-injector en een microscoop voor de visualisatie van de naald.
- Maakt standaardisatie van de lumenmaat van de naald (50 µm) en het vulprotocol (50% minerale olie) noodzakelijk voor een consistente prestatie tussen verschillende gebruikers.
- Aanpassing aan verschillende modelsystemen kan aanpassing van de coördinaten en validatie van de penetratiediepte van de naald vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de technische vaardigheid die nodig is voor het trekken en afschuinen van naalden, en de lage doorvoer die inherent is aan handmatige micro-injectie.
