Differentiële beeldvorming van biologische structuren met dubbel-resonante Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS)

Deze video demonstreert een procedure voor het uitvoeren van differentiële beeldvorming van twee ramen-resonanties die geassocieerd zijn met biologische structuren met coherente ramen-verstrooiingssignalen. Eerst worden drie gesynchroniseerde kortpuls lasers in tijd en ruimte overlapt. De overlappende pulsen worden vervolgens naar een standaard omgekeerde microscoop gestuurd, waardoor de generatie van coherente ramen-signalen uit microscopische objecten mogelijk wordt.

Signalen worden met behulp van commerciële software omgezet in beelden om de verschillende geproduceerde Raman-signalen te vergelijken. De resultaten geven aan dat het verschil tussen beelden verkregen uit dubbel- en enkel-resonante Raman-signalen zorgt voor een verhoogde gevoeligheid voor zwakke Raman-signalen. Hallo, ik ben Tyler Weeks van het Center for Bio Photonics aan de University of California Davis.

Ik ben Thomas ER van het Center for Bio Photonics en de afdeling Interne Geneeskunde van de University of California Davis. Vandaag tonen we u een procedure voor het gebruik van dubbel-resonante coherente anti-Stokes Raman-verstrooiing voor het produceren van chemisch specifieke beelden van cellen. We gebruiken deze procedure om signalen te detecteren van moleculen die te zwak zijn om direct door coherente anti-Stokes Raman-spectroscopie alleen te worden gedetecteerd.

Laten we beginnen. Om gelijktijdig CARS- en DrCARS-signalen te genereren, zijn drie instelbare en gesynchroniseerde kortpulslaserbronnen nodig. Om deze gesynchroniseerde pulsen te verkrijgen, wordt gestart met een enkele kortpulslaser met een uitgangsvermogen van 10 watt, een vaste golflengte van 1064 nanometer, een vaste impulslengte van zeven picoseconden en een vaste herhalingssnelheid van 76 megahertz.

Met behulp van een reeks halve-golfplaten en polariserende beamsplitterkubussen wordt de straal in drie delen gesplitst. Een halve-golfplaat in combinatie met een polariserende beamsplitterkubus maakt het mogelijk om het vermogen in elk onderdeel van de straal aan te passen zonder de richting ervan te veranderen. Gewoonlijk worden twee stralen ingesteld op ongeveer 4,5 watt elk, en bevat de derde straal het resterende ene watt.

De twee krachtige stralen worden vervolgens gericht op twee onafhankelijke optische parametrische oscillatoren of OPO's. OPO's maken gebruik van frequentiegeneratie om een foton met hoge energie om te zetten in twee fotonen met een lagere energie en verschillende golflengten. Door de temperatuur van het kristal dat voor dit effect wordt gebruikt te regelen, kunnen de golflengten van de resulterende fotonen met een nauwkeurigheid van 0,1 nanometer worden beheerst.

Door deze signalen in frequentie te verdubbelen, kan een laser met een vaste golflengte van 1064 nanometers nu worden omgevormd tot een laserstraal die overal tussen 780 nanometers en 910 nanometers kan worden afgestemd door twee afzonderlijke OPO's te pompen met dezelfde 1064 nanometer bron. Er worden twee onafhankelijk afstembare laserbronnen verkregen die automatisch gesynchroniseerd zijn met onze oorspronkelijke pomplaser. De derde straal van de 1064 nanometer pomplaser wordt door een combinatie van diëlektrische spiegels rond de OPO's geleid, zodat alle drie de stralen later kunnen worden gecombineerd.

Om op efficiënte wijze coherente ramen-signaalfotonen te produceren, moeten de gecombineerde pulsen zowel temporeel als ruimtelijk overlappen. Omdat OPO's ringcaviteiten bevatten waardoor elke laserpuls meerdere keren door het kristal gaat, legt de bundel die door de OPO's wordt gestuurd een extra afstand af, wat resulteert in een aanzienlijke vertraging ten opzichte van de oorspronkelijke pompbundel. Deze afstand moet worden gecompenseerd met een derde bundel door extra spiegels te plaatsen die deze bundel dwingen dezelfde afstand af te leggen als de andere twee voordat ze met behulp van dichroïsche spiegels worden gecombineerd, zodat een nauwkeurige afstelling van de weglengte mogelijk is. Elke bundel wordt door verstelbare vertragingsstations gestuurd, waarmee de temporele overlap van de verschillende laserpulsen kan worden aangepast.

Een weitere set halve-golfplaten en polariserende beamsplitterkubussen wordt aan elke bundel toegevoegd om de laserintensiteit van elke bundel onafhankelijk te kunnen aanpassen. Dichroïsche spiegels worden gebruikt om eerst de bundels van de twee OPO's te combineren en vervolgens de 1064 nanometer bundel; er moet nauwkeurig worden toegezien op een precieze ruimtelijke overlap van de bundels. Dit kan worden geverifieerd door de overlap van de bundels op enkele centimeters afstand van de dichroïsche spiegel te vergelijken met de overlap op ongeveer één meter afstand van de dichroïsche spiegel.

Omdat blootstelling aan laserstralen met een hoog gemiddeld vermogen het monster kan beschadigen, worden de drie gecombineerde stralen door een elektrische optische modulator gestuurd die fungeert als pulse picker; hiermee kan de herhalingssnelheid van de pulsen die het monster bereiken, en daarmee het gemiddelde vermogen, worden aangepast. De gecombineerde laserstralen worden vervolgens gekoppeld aan een geïnverteerde microscoop met een objectieflens met een hoge numerieke apertuur of na. De sterke focussering die wordt gegenereerd door de objectieflens met hoge NA maakt de meest efficiënte generatie van coherente ramen-signalen op microscopische lengteschalen mogelijk.

De objectieflens van de microscoop is gemonteerd op een X, Y, Z piëzotabel, waardoor beelden kunnen worden verkregen door de stralen over het monster te rasterscannen, vergelijkbaar met commerciële beamscanning confocale microscopen. Laten we nu kijken hoe CARS- en DR-FWM-signalen worden gegenereerd; de interactie van drie kortgepulste laserstralen in het monster resulteert in de generatie van verschillende four-wave mixing signalen, zoals CARS uit diverse combinaties van twee lasers, evenals driekleurige CARS- en DR-CARS-signalen uit de combinatie van alle drie de lasers. Wanneer signalen relatief dicht bij elkaar liggen in golflengte, kan het moeilijk zijn om ze voor analyse te scheiden.

Om deze reden worden signalen doorgegeven aan een imaging spectrometer die tevens dient als monochromator of banddoorlaatfilter om signalen bij verschillende golflengten ruimtelijk te scheiden. Een elektronisch aangestuurde kantelspiegel in de spectrometer stuurt in de verlaagde positie het signaal naar een back-illuminated deep depletion charge coupled device of CCD-camera; deze levert spectroscopische informatie over het volledige signaalbereik en stelt ons in staat de verschillende coherente robin-signalen te identificeren en te optimaliseren om het signaal voor beeldvorming te selecteren. Draai eenvoudig het rooster binnen de spectrometer door middel van de door de leverancier meegeleverde besturings- en data-acquisitiesoftware om de piek van belang op de CCD-camera te centreren.

Verander vervolgens de positie van de kantelspiegel om het signaal om te leiden naar een tweede uitgangspoort waaraan een single photon counting avalanche photo DDE of een PD is gekoppeld. Scan de objectieflens in een rasterpatroon en gebruik vervolgens de op de A PD geregistreerde signalen om een afbeelding te genereren door de fotontellingssnelheid per pixel weer te geven met de data-acquisitiesoftware. Herhaal deze beeldvormingsprocedure voor elk gewenst coherent ramen-signaal, zodat de signalen tijdens de nabewerking kunnen worden vergeleken.

Laten we nu bekijken hoe een monster correct wordt geprepareerd om heldere, reproduceerbare beelden te verkrijgen. Bij de preparatie van de monsters is zorgvuldigheid geboden. Monsters worden doorgaans geprepareerd op glazen dekglasplaatjes met een dikte van ongeveer 150 micron.

Deze dekglasjes zijn dun genoeg om beeldvorming met een hoge resolutie mogelijk te maken met de water- of olie-immersieobjectieven met een hoge NA die in deze experimenten worden gebruikt. Om de preparatie van een typisch monster te demonstreren, bereiden we coupes van muisspierweefsel met een dikte van ongeveer 20 micron voor, die op een microscopische objectglas worden gefixeerd. Een druppel van 20 µL van een vijf molar gedeutereerde glucoselaag wordt aan het monster toegevoegd.

De gedeuteerde glucoseloplossing zorgt voor een unieke en sterke Raman-achtergrondsignatuur. Een glazen dekglas wordt bovenop het monster geplaatst en met nagellak vastgezet voor cellen en culturen. Er kunnen kweekschaaltjes met een glazen bodem worden gebruikt, waardoor beeldvorming mogelijk is zonder dat de cellen van hun kweekschalen hoeven te worden losgemaakt.

Laten we nu bekijken hoe de juiste Raman-pieken voor Dr. cars worden bepaald. Om optimaal gebruik te maken van het dubbel resonantie-versterkingseffect, moeten de Ramanspectra van beide Raman-resonante stoffen bekend zijn. Meestal zijn dit 2845 cm⁻¹ geassocieerd met lipiden en 2121 cm⁻¹ voor de CD-strekmodus geassocieerd met de gedeutereerde glucose.

Coherente Raman-verstrooiing wordt bereikt wanneer het frequentieverschil tussen twee lasers overeenkomt met de frequentie van een moleculaire vibratie. Door één OPO af te stemmen op 817 nanometer, zal deze de C-modus van 2.845 inverse centimeter sonderen in combinatie met de 1064 nanometer laserstraal, en door de andere OPO af te stemmen op 868 nanometer, zal deze de 2.121 inverse centimeter sonderen in combinatie met de 1064 nanometer straal. In de spectroscopische modus stelt de CARS-microscoop ons in staat om drie coherente Raman-signalen van belang te observeren: een CARS-signaal dat de CH-strekvibratie sondeert, een CARS-signaal dat de CD-strekmodus sondeert, en een DR-CARS-signaal dat beide sondeert. In het hier getoonde diagram geven de gestreepte pijlen fotonen van de laser in de OPO's aan en geven de ononderbroken pijlen het resulterende signaal aan.

De doorlopende horizontale lijnen geven de energie van de Raman-vibratie aan en bieden een visuele weergave dat bij DR-cars het gelijktijdig mengen van dezelfde drie inputfotonen twee verschillende Raman-vibraties aanstuurt. De signaalsterkte voor elke piek zal geoptimaliseerd moeten worden door in kleine stappen rond deze pieklocaties af te stemmen. Hier selecteren we elke piek en maken we beelden van sea elgan-wormen in een oplossing van gedegradeerde glucose; het extraheren van aanvullende informatie op basis van deze drie afzonderlijk verkregen beelden vereist enkele vrij eenvoudige beeldbewerkingen.

Eerst moeten de beelden worden genormaliseerd. Een praktische methode voor normalisatie berust op het feit dat lipiden hydrofoob zijn. Dit betekent dat in regio's met een hoge lipidendichtheid de CD-resonantie van de glucose nauwelijks zou moeten bijdragen aan het dubbelresonantiesignaal.

Omgekeerd zouden in gebieden met een pure glucoseloplossing de CH-resonanties van de lipiden eveneens zeer weinig moeten bijdragen. Met dit in gedachten normaliseert u de DR-car afbeelding en de car-afbeelding verkregen op de CD-resonantie van de gedeuteerde glucoseloplossing naar een gebied ver buiten de CL egan's worm dat geen CH-resonantie zou moeten vertonen. Identificeer vervolgens in de CH-resonante car-afbeelding een gebied binnen de worm dat rijk is aan lipiden en normaliseer dit naar het overeenkomstige gebied binnen de genormaliseerde DR-car afbeelding.

Om deze methode correct te laten werken, wordt ervan uitgegaan dat er diep in deze regio geen gedeutereerde glucose aanwezig is. Dit is een veilige aanname, aangezien de lipiden hydrofoob zijn en niet met de oplossing zullen mengen. Door nu het genormaliseerde CH-resonante CAR-beeld af te trekken van het genormaliseerde DR-CAR-beeld, blijft alleen het versterkte CD-resonante signaal over; op soortgelijke wijze kan dit worden gedaan door het genormaliseerde CD-resonante CAR-beeld af te trekken van het genormaliseerde Dr.FWM-beeld.

Alleen het versterkte CH-resonantiesignaal blijft over; hier wordt het ramanspectrum getoond voor een gemodificeerd oliezuur dat een alkynmodificatie bevat. De sterke CH-resonanties bij 2.845 cm⁻¹ en de alkynresonantie bij 2.121 cm⁻¹ zijn beide goed geïsoleerd van de vingerafdrukregio, de regio met dicht opeengepakte pieken, waardoor ze ideale markers zijn voor coherente raman-imaging. Dit is een typisch spectrum van coherente ramansignalen die worden gegenereerd wanneer drie kortpuls-lasers elkaar overlappen in het monster. De pijlen wijzen naar de processen die verantwoordelijk zijn voor elk signaal, zoals weergegeven in de energiediagrammen.

Dit zijn typische resultaten van de beeldvorming van de wormen van C Elgin met behulp van DR CARS en CARS. In de bovenste rij werden de drie zojuist getoonde signalen gebruikt om een worm in een oplossing van gedegradeerde glucose te beelden. In de tweede rij zijn de beelden op passende wijze genormaliseerd en in de derde rij werden de differentiebeelden gegenereerd door elk van de CARS-beelden af te trekken van het DR CARS-beeld. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe Raman-differentiebeeldvorming kan worden uitgevoerd op basis van dubbel resonante coherente antis Raman-microscopie.

Houd bij het uitvoeren van deze procedure rekening met het volgende: het is essentieel om te controleren of de stralen correct overlappen en gesynchroniseerd zijn. Let er daarnaast op dat u het monster niet stoot of verplaatst bij het schakelen tussen verschillende coherente signalen, aangezien dit de analyse zal beïnvloeden. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.