Multicolor Time-lapse imaging van transgene zebravis: Visualizing netvlies Stem Cells geactiveerd door middel van gerichte neuronale cellen Ablation

De expressie van fluorescerende reporters in transgene dieren maakt het mogelijk om cellulaire responsen op experimentele manipulaties in levende ziektegebonden modellen te volgen. Hier wordt selectief celverlies farmacologisch geïnduceerd in zebravis, waarbij resolutie multicolor confocale beelden van de doelcellen en directe buren worden verkregen vóór, direct na en met tussenpozen na de behandeling met het medicijn. Beeldanalyse demonstreert de activering van endogene stamcelpopulaties en de daaropvolgende vervanging van de doelcellen tijdens de herstelfase.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de regeneratieve biologie, zoals: wat zijn de cellulaire en moleculaire mechanismen die worden gebruikt om specifieke celtypen te regenereren? Begin met het overbrengen van transgene eieren, verzameld na paringen, naar een Petrischaal met 0,3 x danio-oplossing op 16 uur na bevruchting. Voeg PTU toe om de tyrosinase-activiteit te remmen voordat er bewijs is van pigmentatie in het betreffende weefsel. Als het embryo niet albino is, incubeer de embryo's dan bij 28,5 °C.

Zodra de reporters zichtbaar zijn, wordt de Petrischaal onder een fluorescente stereozoommicroscoop geplaatst en gesorteerd op de gewenste transgene expressie. Bereid vóór het maken van de beelden een 0,5% low melt aeros monteersuspensie in embryo-medium voor en bewaar deze bij 40 °C.

Voeg indien nodig trica en PTU toe. Meng voorzichtig en breng terug naar 40 °C. Anestheseer de vissen door ze in embryo-medium met trica te plaatsen.

Gedurende ongeveer drie minuten zullen de vissen niet meer reageren. Om de vissen met een micropipet te verplaatsen, zuigt u individuele vissen op in een afgeknotte pipetpunt in een volume van ongeveer 30 µL anesthesie-oplossing. Keer vervolgens de pipet om en laat de vissen naar de bodem zakken.

Raak met de tip de monteeroplossing aan en laat deze door zwaartekracht overgaan. Zorg ervoor dat de agarose niet wordt verdund, zodat deze hergebruikt kan worden. Gooi de resterende anesthesie-oplossing uit de micropipet weg.

Breng vervolgens met dezelfde pipetpunt de vis over naar een Petrischaal. Positioneer de vis voorzichtig in ongeveer 30 µL monteersolution, zodanig dat het gebied van interesse in het midden van de aeros-druppel ligt. Zorg ervoor dat de vis in de gewenste oriëntatie blijft totdat de aeros is gestold.

Indien gewenst kunnen meerdere vissen in één enkele Petrischaal worden gemonteerd. Nadat het aeros is gestold, transporteert u de vissen naar de tafel van de confocale microscoop en voegt u voorzichtig embryo-medium met trica plus of minus PTU toe aan de schaal tot de vissen volledig zijn ondergedompeld. Open de imaging-software en focus op het gebied van interesse voor een optimale beeldvorming van cellulaire en/of moleculaire details.

Gebruik objectieven met een grote werkafstand en een hoge numerieke apertuur in de software. Kies de juiste fluorescente filters uit de keuzelijst. Klik op de spectrale instellingen en pas de emissiebereiken aan.

Om een schone scheiding van reportersignalen te verkrijgen en de signaal-ruisverhoudingen te maximaliseren. Selecteer het juiste objectief in het vervolgkeuzemenu om ervoor te zorgen dat eventuele softwarematig gedefinieerde presets correct worden aangepast. Om de lasers te focussen en de vermogensniveaus in te stellen, selecteert u een output uit de opzoektabel die pixelsaturatie voor elk kanaal vertoont.

Stel vervolgens de gevoeligheid van de detector in om de gewenste beeldkwaliteit te verkrijgen en verhoog geleidelijk het laservermogen totdat de beeldintensiteit acceptabel is. Vermijd pixelsaturatie in het interessegebied en houd de laserinstellingen zo laag mogelijk om fotobleken en fototoxiciteit te beperken.

Controleer of elke laserlijn alleen een detecteerbaar signaal produceert in het bijbehorende kanaal door de lasers handmatig aan en uit te schakelen terwijl alle beeldkanalen worden gemonitord. Als er geen crosstalk zichtbaar is, kunnen alle kanalen gelijktijdig worden vastgelegd. Kader vervolgens het interessegebied in met behulp van de zoom- en rotatiefuncties.

Stel vervolgens de scansnelheid en beeldgrootte in; snellere scansnelheden minimaliseren de verblijftijd van de laser en verhogen de temporele resolutie. Stel de stapgrootte van de Z-dimensie in op basis van de experimentele behoeften. In dit geval wordt een stapgrootte van 10 microns gebruikt om zeven optische secties van retinaal weefsel te beelden.

Zodra de juiste instellingen zijn bepaald, worden de Zack-beelden vastgelegd en opgeslagen. Ga vervolgens over naar de volgende vis. Seriële catch-and-release imaging kan worden uitgevoerd om cellulaire veranderingen over opeenvolgende dagen te volgen, volgens de instructies in het bijbehorende schriftelijke document.

Bij het uitvoeren van een imaging-experiment met meerdere reporters is het bij voorkeur gebruik te maken van fluoroforen die spectraal goed gescheiden zijn; dit is echter niet altijd praktisch. Hier tonen we een eenvoudige methode voor beeldsubtractie met behulp van de opensource-software ImageJ om fluoroforen met overlappende excitatie- en emissieprofielen te scheiden. In ons geval gaat het om GFP en YFP.

De in deze video beschreven time-lapse imaging-technieken zijn gebruikt om GFP-gelabelde retinale stamcellen te monitoren tijdens de ablatie en regeneratie van retinale bipolaire neuronen. Voer voor spectrale scheiding beeldacquisitie uit met sequentiële imaging-modi en variabele barrierfilter-instellingen, waardoor overlappende fluorescenties respectievelijk onafhankelijk kunnen worden vastgelegd en gedeeltelijk kunnen worden gescheiden. Zodra de beelden zijn verkregen, gebruikt u de ImageJ Bio-Formats import om de beeldbestanden te openen en start u de importtool. Sleep het gewenste bestand naar het ImageJ-venster.

Splits de kanalen in individuele stacks door het selectievakje 'split channels' in het importvenster te gebruiken om de plugin 'align three TP' te starten. Klik op plugins, vervolgens op align stacks en daarna op align three tp.

De stacks moeten worden uitgelijnd om een correcte subtractie te waarborgen. Selecteer de referentiestack in het eerste keuzemenu en de niet-uitgelijnde stack in het tweede. Vink de vakjes use XY relative origin en use Z relative origin aan en klik op oké.

Om het uitlijningsproces te starten, klikt u op de knop voor volumeregistratie. Er verschijnt een nieuw venster met de uitlijningsparameters. Klik op oké.

Dit gedeelte is geoptimaliseerd door de distributeur van de plug-in, dus er zijn geen wijzigingen nodig. Wanneer het proces is voltooid, verschijnt er een venster met de uitgelijnde stacks. Selecteer de output in het uitgelijnde venster om het outputvenster te openen.

Dit venster is ook geoptimaliseerd en behoeft geen aanpassing. Klik op oké. Er verschijnt een nieuwe stack in de werkruimte waarbij 'aligned' aan het einde van de bestandsnaam is toegevoegd.

Om crosstalk te verwijderen met de image calculator, klikt u op process en vervolgens op image calculator. Selecteer in het keuzemenu voor image one de stack die moet worden afgetrokken en de stack die voor de aftrekking moet worden gebruikt. Selecteer in het keuzemenu voor image two de optie subtract in het dropdownmenu voor de operatie en klik op okay.

Image J zal vragen om de stack te verwerken. Selecteer ja. Er verschijnt een nieuwe stack waarin de crosstalk tussen overlappende kanalen is verwijderd.

Voeg de stacks samen om dezelfde beeldstructuur van vóór de uitlijning en subtractie te herstellen. Door de samengevoegde kanalen in het venster met kanaaltools te selecteren, maakt de tool het mogelijk om maximaal vier stacks samen te voegen tot een hyper stack. Geef tot slot de kanalen een kleur, pas de helderheid en het contrast aan en sla de bestanden op als tiffs om het doelgerichte verlies en de regeneratie van nitro reductase te bestuderen.

Retinale bipolaire cellen die M-cherry tot expressie brengen. Er is een tijdreeks van confocale beelden gemaakt van individuele zebravisjes voorafgaand aan de behandeling. Er is mozaïekexpressie van een membraangekoppelde YFP-reporter in controle-bipolaire cellen, weergegeven in geel, en een nitroreductase-cherry-fusieprotein in getargete bipolaire cellen, weergegeven in rood.

Het met een membraan gemarkeerde CFP-transgeen, weergegeven in cyaan, biedt contextuele informatie over de meeste andere netvliescellen voor extra duidelijkheid. Dezelfde afbeelding zonder het CFP-signaal wordt getoond na behandeling met metronidazol. De rode nitroreductase-expresserende bipolaire cellen zijn verloren gegaan, terwijl de gele controle-bipolaire cellen gespaard zijn gebleven.

Dit demonstreert de zeer specifieke aard van deze ablatie-methodologie. Opnieuw wordt ter verduidelijking hetzelfde beeld zonder CFP getoond. Wanneer metro NIAZ wordt verwijderd, keren de NTR-expresserende cellen hier terug.

Een voorbeeld van de G-F-P-Y-F-P-subtractiemethode wordt getoond in deze figuur met GFP-gelabelde Mueller-cellen. GL-cellen zijn groen weergegeven en YFP-gelabelde bipolaire cellen zijn paars weergegeven. Overlap tussen de twee produceert wit om de subtractie uit te voeren.

De GFP- en YFP-beelden moeten eerst worden uitgelijnd. Het subtractieproces maakt het vervolgens mogelijk om YFP-gelabelde bipolaire cellen uit het GFP-beeld te verwijderen, zodat GFP-gelabelde Müller-cellen helder kunnen worden weergegeven en zwakkere Müller-cellen kunnen worden gedetecteerd. De overlap tussen zwakke Müller-cellen en M-cherry-gelabelde bipolaire cellen, weergegeven in het rood, kan nu worden geverifieerd.

De hier getoonde gegevens suggereren dat de ablatie van bipolaire cellen ertoe leidt dat mullar ggl de verloren cellen vervangt. Deze interpretatie is in overeenstemming met recente studies naar retinaal herstel, waarbij Mueller Ggl worden aangewezen als door letsel geïnduceerde progenitorcellen bij zowel zoogdieren als vissen. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om mechanismen die de regeneratie van specifieke celtypen reguleren te onderzoeken door middel van visualisatie van stamcellen in zebravis.