Een methode voor Murine Islet Isolatie en subcapsulaire Niertransplantatie

Eilandjetransplantatie is voorgesteld als een potentiële behandeling voor diabetes type 1. Er zijn echter twee grote beperkingen die voorkomen dat dit een wijdverbreide klinische realiteit wordt. Ten eerste is er een groot aantal eilandjes per ontvanger nodig.

Aangezien eilandjes van pancreasdonoren worden verkregen, is het aantal potentiële ontvangers ernstig beperkt. Een tweede transplantatie vereist een levenslange behandeling met sterke immunosuppressiva, waardoor de patiënt, en met name de pediatrische populatie, een risico loopt op maligniteiten, infecties en nierfalen. Transplantatie van eilandjes onder het nierscapsel van de muis wordt uitgevoerd om strategieën te onderzoeken voor het verbeteren van de klinische transplantatieresultaten.

Eilandjes van Langerhansaanvullend geïsoleerd uit gezonde donormuizen, verdeeld in groepen en voorbereid voor transplantatie. De eilandjes worden vervolgens getransplanteerd in de subcapsulaire ruimte van de nier. Bij diabetische recipiëntmuizen wordt de functie van het eilandjegraft beoordeeld door de bloedglucosewaarden te bewaken, waaruit blijkt dat ongeveer 250 tot 350 eilandjes de glycemie herstellen in een recipiëntmuis van 20 gram binnen 24 uur na transplantatie.

Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel voor de stappen bij het canuleren. De ductus choledochus en de overdracht van de oogjes naar de subcapsulaire ruimte van de nier zijn moeilijk aan te leren. Deze stappen vereisen een identificatie van weefselstructuren, vaste handen en het gebruik van een techniek die weefselschade minimaliseert.

Plaats een geëuthanaseerde muis in rugligging op een papieren handdoek onder de dissectiescoop en besproei de buik met 70% ethanol. Gebruik een schaar om de buikholte te openen met een V-vormige incisie vanaf de schaamstreek naar beide voorpoten. De muis bevindt zich onder de dissectiescoop.

Positioneer het zodanig dat de kop naar de waarnemer is gericht. Lokaliseer de duodenale ingang van de gemeenschappelijke galgang met een hemostatische klem, de duodenale opening van de gemeenschappelijke galgang. De hemostat moet zo worden geplaatst dat deze bij compressie exact langs de grens tussen de pancreas en de darm loopt.

Hier worden twee methoden voor het canuleren van de galgang gedemonstreerd: de methode met de vrije hand en de methode met ondersteuning van een pincet om de galgang te canuleren. Trek bij de methode met de vrije hand de hemostat, die op het duodenum is geklemd, weg van de kop van de muis richting de staart, zodat de gemeenschappelijke galgang strak komt te staan.

Er bevindt zich een samenvloeiing in de galgang nabij de lever, waar de gal uit de galblaas en de enzymen uit de lever samenkomen. Trek de galgang strak voordat deze de darmen binnengaat, om de binnenkant van de V-positie bloot te leggen. Gebruik een gebogen 27 gauge naald bevestigd aan een spuit van 5 mL, zodat de naald recht door de V glijdt om het onderste gedeelte van de gang direct te canuleren. Schuif de naald enkele millimeters voorbij het uiteinde van de schuin geslepen punt om terugstroom naar de lever en galblaas te voorkomen.

Zodra de canulatie is geslaagd, wordt de pancreas geperfuseerd door twee milliliters liase uit de spuit toe te dienen. Let op de uitzetting van de pancreas over de maag als indicatie van een optimale canulatie. Alternatief kan de galgang worden gecanuleerd.

Gebruik de forceps cyst-methode. Trek de hemostat C die op het duodenum is geklemd, weg van de kop van de muis richting de staart, zodat de ductus choledochus strak komt te staan. Punctureer vervolgens, met behulp van een gebogen 27 gauge naald bevestigd aan een spuit van vijf milliliter, de fascia onder de ductus choledochus dicht bij de lever.

Gebruik de naald om de fascia rond de duct vrij te maken terwijl de naald op zijn plaats blijft. Leg de hemostat neer en pak een pincet. Gebruik één arm van het open pincet om de galgang te ondersteunen op de plek waar de naald de fascia heeft vrijgemaakt, terwijl u de galgang en het pincet naar voren trekt.

Schuif de naald in het kanaal met de pincet als steunpunt. Een succesvolle canulatie wordt aangegeven door een gelijkmatige uitzetting van het pancreasgebied bovenop de maag. Zodra de pancreas is geperfuseerd, verwijdert u de hemostat uit het duodenum.

Gebruik vervolgens de pincet om het duodenum op te tillen en gebruik een tweede pincet om de pancreas van de darmen te scheiden. Trek daarna de pancreas los van de bovenkant van de maag en de milt. Til tot slot de pancreas uit de buikholte en snijd deze los van de resterende fasciaverbindingen met de darm, maag en milt.

Plaats de pancreas in een conische buis van 50 milliliter en zet deze op ijs. Incubeer de pancreas bij 37 degrees Celsius volgens de instructies in het bijbehorende schriftelijke protocol. Voeg na incubatie 20 milliliters medium toe aan de buizen en dissocieer het weefsel door de buizen gedurende 10 seconden 40 keer krachtig te schudden.

Deze stap is cruciaal voor een optimale recovery van violets. Centrifugeer de cellen bij 800 toeren per minuut. Resuspendeer het pellet in 15 milliliters medium en concentreer de monsters.

Giet het resuspenderde mengsel door een draadgaas van 0,419 millimeter en vang dit op in een nieuwe conische buis van 50 milliliter. Spoel de eerste buis met nog eens 10 milliliter medium dat 10% foetaal runderserum bevat en giet dit door het draadgaas. Pelleteer de cellen door centrifugatie, resuspendeer het pellet in vijf milliliter Isotonic OptiPrep 10% bij kamertemperatuur. Vortex vervolgens voorzichtig gedurende enkele seconden en voeg nog eens vijf milliliter Isotonic OptiPrep toe; spoel de binnenkant van de buis om de cellen van de wand te wassen. Pipetteer langzaam 10 milliliter serumvrij RPMI langs de wand van de buis met een snelheid van één milliliter per 10 seconden om een laag aan te brengen.

Er moet een scherpe interface zichtbaar zijn. Centrifugeer de monsters vervolgens in een centrifuge met zwaaibekers bij 20 °C en 900 ×g gedurende 20 minuten met een zeer trage versnelling en zonder afremming na de centrifugatie; de eilandjes worden vervolgens gescheiden van de exocriene cellen met een wegwerpbare serologische pipette van 10 mL. Breng de eilandjes van de HistoPaque-mediuminterface over naar een nieuwe conische buis van 50 mL.

Verschillende buisjes kunnen op dit punt worden samengevoegd om de resterende eyelets te verwijderen, vul de ondoorzichtige buisjes met serumhoudend medium en pellet de eilandjes door de buisjes twee minuten te centrifugeren bij 800 toeren per minuut. Resuspendeer de eilandjes vervolgens in vers medium. Herhaal deze stap ten minste twee keer.

Resuspendeer het pellet in vijf milliliter medium. Plaats een nylon celzeef van 0,1 millimeter ondersteboven op een conische buis van 15 milliliter. Pipetteer de geresuspendeerde celsuspensie hierdoorheen om de eyelets te verzamelen.

Spoel de buis van 50 milliliter vervolgens met nog eens zes milliliter medium en laat dit door de zeef lopen. Plaats een druppel van drie milliliter medium in een Petri-schaal van 10 centimeter. Keer de celzeef om en dip deze in de druppel medium om de oogjes op te vangen; pipetteer vervolgens nog eens vijf tot zeven milliliter kweekmedium door de zeef in de Petri-schaal.

Om eventuele resterende oogbekers uit de zeef te verzamelen onder een 4× objectief, worden de oogbekers individueel opgepikt met een P 200 pipette en overgebracht naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje. Deze afbeeldingen tonen oogbekers geïsoleerd van 12 weken oude C 57 black six muizen. De zuiverheid en kwaliteit van de oogbekers kunnen microscopisch worden geschat na voltooiing van de isolatieprocedure.

De twee hier getoonde afbeeldingen laten bijvoorbeeld een representatief gezichtsveld zien waarin debris en contaminatie door exocriene cellen aanwezig zijn. Vermijd bij het selecteren van oogjes voor een experiment het kiezen van contaminerende exocriene cellen of oogjes die ongezond lijken. Oogjes met necrotische centra zijn ongezond, zoals te zien is in deze figuur die 24 uur na isolatie is genomen; necrotische centra zijn onmiddellijk na isolatie niet zichtbaar.

Eilandjes die cellen afstoten zijn onvermijdelijk en kunnen worden gebruikt bij eilandjes transplantatie in deze time-lapse video van 24 uur van eilandjes. Direct na isolatie ontwikkelen zich necrotische centra in veel van de eilandjes. Deze necrotische centra lijken aan het einde van de opname uit het eilandje te worden uitgestoten tijdens het selecteren van de eilandjes.

Groepeer ze zodanig dat elke buis een gelijkmatige verdeling van de kwaliteit en grootte van de oogjes heeft. Bijvoorbeeld, elke groep van 15 oogjes kan vier grote oogjes, zes middelgrote oogjes en vijf kleine oogjes bevatten. Plaats de buis op ijs; de oogjes kunnen onmiddellijk voor transplantatie worden gebruikt of verder worden bewerkt.

Voor gebruik: Plaats een steriele gel-laadpunt in de opening van een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje, zodanig dat er een lichte buiging ontstaat die een U-vorm vormt in het smalle uiteinde van de punt. Beide openingen van de punt moeten recht omhoog wijzen, uit het microcentrifugebuisje.

Haal voorzichtig een buisje met eyelets uit het ijs. Controleer of alle eyelets naar de bodem van het buisje zijn gezakt. Verzamel de eyelets voorzichtig in een minimaal volume vanaf de bodem van het buisje met een P 200 pipet en breng ze over naar de voorbereide gebogen tip.

Nadat de eilandjes zijn bezonken, verwijdert u zoveel mogelijk medium uit de tip door het medium te aspireren via de grote opening van de gel-laadtip die de eilandjes bevat met een nieuwe gel-laadtip bevestigd aan een P 200 pipette. Bevestig het niet-afgeschuinde uiteinde van de slang aan de smalle opening van de gel-laadtip met de eilandjes. Bevestig vervolgens de tip aan een P 200 pipette en duw de eilandjes voorzichtig in de slang.

Sluit vervolgens de niet-afgeschuinde zijde van de PE 50-buis aan op de naald van een Hamilton-spuit van 25 µL. Trek de zuiger naar buiten en druk vervolgens op de zuiger van de spuit totdat de oogjes zich op ongeveer 0,5 cm van de afgeschuinde opening bevinden. Zet de spuit opzij zodat de oogjes kunnen samensmelten tot één massa nabij de afgeschuinde opening van de buis, terwijl de nier wordt voorbereid op de ontvangst van de oogjes.

Bereid de operatielocatie voor door het haar weg te knippen en de huid drie keer afwisselend te scrubben met Betadine en 70% isopropyl alcohol. Begin de oogjes-transplantatieprocedure door een knijptest bij de teen uit te voeren om de anesthesie bij de recipiënte muis te bevestigen. Plaats de schacht van een glazen staafje direct onder de muis en onder de nier, loodrecht op het ruggenmerg.

Lokaliseer vervolgens de nier door de huid en breng een steriel chirurgisch afdekdoek aan. Zodra de nier is gelokaliseerd, gebruik je McFerson-banis-scharen om een incisie van twee centimeter door de dermis te maken, direct boven de nier en loodrecht op het ruggenmerg. Met de schaar wordt door deze incisie de peritoneale wand blootgelegd.

Maak een incisie van één centimeter door de peritoneale wand in dezelfde richting als de snede door de dermale laag, waarbij de schacht van de glazen staaf als steun wordt gebruikt; duw de nier door de peritoneale opening door op het aangrenzende oppervlak te drukken. Bevochtig het oppervlak van de blootgelegde nier met ijskoud, steriel PBS met behulp van een gedrenkte wattenstaaf. Herhaal deze stap elke paar minuten indien nodig om te voorkomen dat het nierkapsel uitdroogt.

Maak met een naald van 27 gauge een incisie van 0,2 centimeter door het niersuccapsel over het anterieure oppervlak van de nier. Voer een vlamgetrokken glazen capillaire buis in, waarbij u zich van de linkerlaterale zijde naar de rechterlaterale zijde beweegt. Sondeer door de eerder gemaakte incisie en beweeg de buis in posteriore richting langs het dorsolaterale oppervlak van de nier.

Om een zakje tussen het nierscapsule en het nierparenchym te creëren, verschuift u de oogjes in de voorbereide 25 milliliter Hamilton-spuit naar de uiterste rand van de schuine opening van de flexibele buis. Voer vervolgens de schuine rand met de opening naar boven in het subcapsulaire zakje in. De lange rand is in contact met het nierparenchym.

Verplaats de tube naar het meest posterieure uiteinde van het kapsel. Breng vervolgens de oogjes langzaam van de PE 50 tube over naar de subcapsulaire pouch door de plunjer van de spuit in te drukken. Terwijl de oogjes de pouch vullen, trekt u de flexibele tube langzaam terug om meer ruimte te maken.

Nadat de buis uit het zakje is verwijderd, schuift u de glazen probe langs het buitenoppervlak van de nier van anterieur naar posterieur om de oogjes voorzichtig in het proximale uiteinde van het zakje te duwen. Til met een gebogen pincet het peritoneale voering op naast de opening die voor de nier is gemaakt. Gebruik vervolgens een met PBS gedrenkte wattenstaaf om de nier voorzichtig terug in de peritoneale holte te duwen.

Sluit de muis door hechtingen aan te brengen in de peritoneale wand en wondclips in de dermale laag. Plaats de muis terug in de kooi en monitor deze. Voor het herstel moet aceto-meine water worden aangeboden voor de darmen van de muis.

Geïsoleerde oogleden van C-muizen. Met behulp van de in deze video beschreven methoden werd een curatieve dosis getransplanteerd in allogene C 57 black six-muizen. De nuchtere bloedglucosewaarden werden gemonitord vanaf de eerste postoperatieve dag.

Afstoting is waarneembaar rond dag 17 bij recipientmuizen van 20 gram die 300 eilandjes ontvingen van een allogene donor Hier. Het herstel werd gemonitord bij muizen die ofwel 150 eilandjes ofwel 300 eilandjes ontvingen van syngene donors. Bij deze transplantaties wordt geen afstoting waargenomen, aangezien de eilandjes afkomstig zijn van syngene donors.

De toegediende dosis eilandjes meet de primaire functie van de eilandjes direct na transplantatie. Hoewel bij 150 eilandjes een marginaal herstel werd waargenomen, trad een volledig herstel op wanneer 300 eilandjes werden getransplanteerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het uitvoeren van de kritieke stappen die nodig zijn om muiseilandjes te isoleren en deze eilandjes onder de subcapsulaire ruimte van de nier te transplanteren.

Met oefening zult u het vermogen ontwikkelen om de ductus choledochus snel te canuleren, wat de moeilijkste stap van dit protocol is.