Genoom-brede analyse met behulp van chip Isoform-specifieke Gene targets te identificeren

Het algemene doel van het volgende experiment is om genomische targets van KDM5A (Jarid1A), een RBB2 histondemethylase, te identificeren. Dit wordt bereikt door de preparatie van cross-linked chromatine, dat in een tweede stap wordt gesoniceerd om DNA-fragmenten van de juiste grootte te produceren. RBB2-gebonden DNA-fragmenten worden vervolgens geïmmunoprecipiteerd met RBB2-antilichamen.

Vervolgens wordt het teruggewonnen genomisch DNA via PCR geamplificeerd voor sequencing. Ten slotte worden de door Illumina gesequenced short reads uniek uitgelijnd op het menselijk genoom, waarna significante pieken worden geïdentificeerd en geannoteerd naar de dichtstbijzijnde genen. Om rbbb twee doelgenen te identificeren, worden resultaten verkregen die moleculaire functies tonen die geassocieerd zijn met Rrb B twee doelgenen, gebaseerd op genoombrede identificatie van Rbbb twee verrijkte regio's.

Hoi, ik ben Mike, van het laboratorium van Dr. Elizabeth Bencia van de afdeling Biochemie en Moleculaire Genetica aan de Universiteit van Illinois in Chicago. En ik ben ala, van het laboratorium voor Biomedische Genomics onder leiding van Dr. NGA aan het BARCEL Biomedical Research Park University PO P fea.

En ik ben Danielle Dal. En ik ben William Richter. Wij zijn beiden ook werkzaam in het Benevolence Skill Lab.

Vandaag laten we u een procedure zien voor chromatine-immunoprecipitatie en sequencing. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de bindingsplaats van histon-demethylasen te bestuderen. Laten we beginnen.

Om deze procedure te starten, kweek ongeveer 10⁸ cellen voor elke immunoprecipitatie of ip van diffuus osteolytisch lymfoom.

U 9 37 cellen worden gebruikt en geïnduceerd voor monocytaire differentiatie met TPA gedurende 96 uur na celgroei, waarna formaldehyde-oplossing direct aan het medium wordt toegevoegd tot een eindconcentratie van 1%. Draai de kolf vervolgens kort rond en laat ze 10 minuten op kamertemperatuur staan. Aspireer daarna het medium en spoel de cellen af met 15 milliliter ijskoud PBS. Herhaal deze wasstap één keer.

Voeg vervolgens zes milliliter lysisbuffer één toe aan elke kolf op ijs. Schud de kolven daarna 20 minuten lang bij vier graden Celsius. Oogst tenslotte de cellen met een celschraper en breng deze over naar 15 milliliter conische buizen.

Op dit punt kunnen de cellen worden bewaard bij -80 °C. Als de cellen waren ingevroren, ontdooi deze dan. Draai de cellen na het ontdooien in een centrifuge en verwijder het supernatant.

Resuspendeer de cellen vervolgens in zes milliliter lysisbuffer twee en schud de buisjes voorzichtig bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Herhaal de centrifugatie en resuspendeer de cellen in 2,5 milliliter lysisbuffer drie. Bereid de suspensie vervolgens voor op sonicatie door deze in een bekerglas met ijswater te plaatsen, waarbij de microtip van een Branson 450 sonicator wordt ingesteld op een amplitude tussen 50 en 60%.

Sonicate de oplossing gedurende een 32e constante burst en koel op ijs. Herhaal deze pulsen gedurende één minuut 10 tot 15 keer, pipetteer vervolgens de inhoud van de buis op en neer en breng deze over naar een nieuwe buis. Ga door met het pulseren en koelen van de oplossing.

Voeg na nog vijf keer soniceren 10% Triton X 100 toe aan één tiende van het oplossingsvolume. Draag de lysaten vervolgens over naar centrifugebuisjes van 1,5 milliliter en centrifugeer de debris in een microcentrifuge voorafgaand aan chromatine-immunoprecipitatie of chip. Bewaar 50 microliters van het cellysaat als inputmonster.

Combine vervolgens het geklaarde cellysaat met dyna beads gebonden aan antilichamen, die vooraf waren bereid zoals beschreven in het geschreven protocol. Laat het mengsel, samen met het inputmonster van 50 µL, overnight bij vier °C schudden op een rocker. Was de beads met 1 mL wasbuffer.

Gebruik vervolgens een magnetische standaard om de beads te verzamelen en verwijder het supernatant. Herhaal deze wasstap zes tot acht keer. Voer een laatste wasbeurt uit met 1 ml TE plus 50 mM natriumchloride.

Centrifugeer de kraaltjes in een microcentrifuge en zuig daarna eventueel resterende TE-buffer af. Voeg vervolgens onmiddellijk 100 µL elutiebuffer toe aan de monsters.

Incubeer de monsters gedurende 10 tot 15 minuten bij 65 °C. Schud de buisjes elke twee minuten tegen een rekje voor 1,5 ml buisjes om de beads in suspensie te houden. Verzamel de beads middels centrifugatie en het magnetische statief en breng het SNAT over naar een PCR-buisje.

Haal vervolgens het eerder bewaarde inputmonster op en voeg drie volumes van de elutiebuffer toe. Plaats tot slot de IP- en inputmonsters overnacht in de thermocycler bij 65 °C. Voeg de volgende dag één volume TE-buffer toe aan de monsters om de crosslinks te verbreken.

Voeg vervolgens RNA's A toe tot een eindconcentratie van 0,2 µg/µL. Incubeer de monsters in de thermocycler gedurende één tot twee uur bij 37 °C. Voeg na incubatie proteinase K toe tot een eindconcentratie van 0,2 µg/µL.

Incubeer de monsters vervolgens in de thermocycler bij 55 °C gedurende twee uur. Extraheer de monsters daarna één keer met één volume fenol. Extraheer de monsters een tweede keer met één volume fenol-chloroform-isoamylalcohol.

Extraheer de monsters ten slotte nogmaals met één volume chloroform-isoamylalcohol. Voeg vervolgens 30 microgram glycogeen toe aan elk monster. Voeg daarnaast natriumchloride toe tot een eindconcentratie van 0,2 molair en twee volumes ethanol aan de monsters.

Incubeer ze gedurende 30 minuten bij -80 °C. Centrifugeer na incubatie de monsters en schenk het supernatant af. Was de pellets met 500 µL 75% ethanol, droog de pellets vervolgens en resuspendeer ze in 40 µL water.

Om de grootte van de DNA-fragmenten te controleren die door de SONICATIE-procedure zijn geproduceerd, wordt vijf microgram van het gezuiverde inputmonster in een 1,8% agarosegel geladen en wordt de gel gerund. De sonicatieprocedure moet fragmenten opleveren in het bereik van 150 tot 350 basenparen. Indien de fragmenten echter niet in dit bereik vallen, moet de sonicatieprocedure worden aangepast door het aantal bursts en de amplitude te variëren voorafgaand aan de amplificatie van genomisch DNA.

Controleer de grootte, concentratie en verrijking van de monsters zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Om de amplificatie van genomisch DNA te starten, neem 34 microliters van het IP-monster en 200 nanogrammen van het input-monster. Voer de toevoeging van een staart en de ligatie van adapters aan DNA-fragmenten uit en repareer deze met behulp van een Illumina genomisch DNA-sample prep kit, zoals beschreven in het schriftelijke protocol.

Zuiver het DNA met een mini lut PCR-zuiveringskit en elueer het vervolgens in buffer EB die is voorverwarmd tot 50 °C. Gebruik respectievelijk 23 µL en 46 µL voor de IP- en input-DNA-monsters. Stel de PCR-reactie samen met 23 µL DNA met adapters en 25 µL fusie-DNA-polymerase uit de kit.

Voeg één microliter van 20 micromolair sole PCR one en één microliter van 20 micromolair sole PCR two toe. Voer de PCR-reactie uit zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Zuiver na de PCR-amplificatie het DNA met de Qiagen mini loop PCR-zuiveringskit.

Verwarm 15 µL buffer EB voor tot 50 °C en verdun de DNA-sample één op vier met 0,5 µL van de sample; voer vervolgens een NanoDrop-meting uit om de geamplificeerde producten te zuiveren. Bereid een AGROS-gel van 1,8% en 50 mL met HPLC-grade water; voeg TAE en bromide toe zodra de AGROS is gesmolten. Giet vervolgens de gel en laad de gel.

Voeg vier µL ladingsbuffer toe aan de input- en IP-monsters en laat de gel vervolgens 45 minuten lopen bij 120 volt. Analyseer de gel na afloop. Hieruit moet blijken dat fragmenten in het bereik tussen 150 en 350 baseparen zijn geproduceerd.

Deze vertegenwoordigen genomische DNA-fragmenten met een lengte tussen 50 en 250 basenparen. Gebruik een scalpel om het gebied van de gel uit te snijden dat het materiaal in het bereik van 150 tot 350 basenparen bevat. Zorg ervoor dat de adapterband, die rond de 120 basenparen ligt, niet wordt uitgesneden.

Herstel het DNA met een kayak quick gel extraction kit volgens de instructies van de fabrikant. Droog het monster zonder warmte op tot precies 11 µL in een speedvac. Neem één µL van het monster af en meet de DNA-concentratie met een NanoDrop-spectrofotometer.

Identificeer tenslotte verrijkte genproducten met behulp van de Illumina genome analyzer en analyseer de bindingsplaatsen en doelgenen zoals beschreven in het schriftelijke protocol. De genomische coördinaten van de geïdentificeerde verrijkte RB-bindend eiwit twee- of RBP2-bindingsregio's worden in een per chromosoom geordend formaat gepresenteerd. De bezettingen van ensemble-genen in de chromosomen kunnen worden gevisualiseerd als zwarte VAR's.

Hier worden de bezettingen van chromosoom 10 getoond; rbp twee-bindingsregio's zijn aangegeven als verticale lijnen. Het middelste paneel toont alle bindingsregio's van rbp twee-isovormen op chromosoom 10, en het onderste paneel toont de bindingsregio's van de grote rbp twee-isovorm. Deze informatie geeft een overzicht van de overlappende en specifieke bezetting van RBP twee-isovormen op chromosoom 10.

Hier wordt een heat map getoond met significant verrijkte gene ontology (GO) moleculaire functiecategorieën onder de genen die gebonden zijn door rbp, gecorrigeerd voor de false discovery rate (FDR). Kleuren die neigen naar rood duiden op een hoge statistische significantie. Geel duidt op een lage statistische significantie en grijs duidt op geen statistische significantie.

Verrijkingsanalyse toont de overlappende en isoform-specifieke moleculaire functies van R BP twee doelgenen aan. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe men tijdens deze procedure transcriptionele factor-bindingsplaatsen identificeert. Het is belangrijk om DNA-fragmenten te produceren met het juiste groottebereik en de juiste opbrengst.

Dit kan worden bereikt door onze richtlijnen te volgen tijdens de SONICATIE-stap. Dat is alles. Veel succes met uw experimenten en bedankt voor het kijken.