Visualisatie van larvale Segmentale zenuwen in 3 ^Rd Instar Drosophila Larvale Voorbereidingen

Axonaal transport kan worden bestudeerd door de segmentale zenuwen van de larve te visualiseren. Een derde instarium drosophila. De larve wordt eerst gedisseceerd, waardoor het CZS wordt blootgelegd zonder de optische lobben, het ventrale ganglion en de segmentale zenuwen te beschadigen.

De tweede stap van de procedure is het fixeren van de lava in formaldehyde vóór incubatie met het primaire antilichaam gedurende de nacht en het secundaire antilichaam gedurende een uur in het donker. De lava wordt vervolgens op een glazen objectglas gemonteerd en defecten in het axonale transport, de eiwitlokalisatie en de eiwitdistributie kunnen worden onderzocht via immunofluorescentiemicroscopie.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in axonaal transport, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals de morfologie van synapsen en spieren. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat het in het begin lastig is om deze toegestane dissectie uit te voeren, in het bijzonder om de segmentale zenuwen en spieren van het brein intact te houden. Om deze procedure te starten, bereidt u een eenmaal dissection buffer fixative, een eenmaal PBT en een 5% BSA-oplossing voor.

Verzamel, zoals beschreven in de tabel voorafgaand aan de dissectie, een schoon paar pincetten nummer vijf, een schoon paar scharen met recht blad en spelden om de dissectie te starten. Gebruik een microlepel om derde-stadium larven met een specifiek genotype op een Petrischaal te verzamelen. Was de larven vervolgens door ze af te spoelen in een Petrischaal gevuld met gedeïoniseerd water om alle voedselresten te verwijderen.

Plaats vervolgens een larve met de dorsale zijde naar boven op de S-bewaarpetrischaal. Zet de larve aan de anterior en posterior vast met spelden. Breng met een fijne pincet een druppel van de eenmalige dissectiebuffer aan op de vastgezette larve.

Knip de lava op de dorsale middenlijn nabij het posterieure uiteinde door. Snijd met de schaar de cuticula van de lava door van het posterieure uiteinde naar het anterieure uiteinde. Plaats een druppel nieuwe 1× dissectiebuffer op de gedisseceerde lava.

Pak met een speld een laterale rand van de cuticula nabij het midden van de larve en zet de cuticula vast met een andere speld. Zet de tweede laterale rand van de cuticula vast; er worden twee spelden per laterale zijde gebruikt, zoals weergegeven in het diagram. Verwijder nu voorzichtig de darm, de vetlichamen en de trachea, zodat alleen de hersenen met de twee optische lobben en de ventrale ganglia overblijven.

Nadat de segmentale zenuwen zijn bevestigd, worden de fixatie en antilichaamkleuring uitgevoerd terwijl de larven aan het guard-schaaltje zijn bevestigd. Incubeer de gedisseceerde larven gedurende 30 minuten in 50 µL fixatief. Vervang het fixatief elke 15 minuten. Spoel de larven na de fixatie gedurende 30 minuten in één keer PBT.

Bij het vervangen van de buffer elke 10 minuten is het belangrijk op te merken dat de larven altijd in buffer ondergedompeld moeten blijven. Bereid de primaire antilichaamoplossing door deze te verdunnen tot de juiste concentratie in de 5% BSA-oplossing. Optimale concentraties verschillen per antilichaam.

Maak een bevochtigingskamer door een plastic schaal te bekleden met water-gedrenkte Kimwipes. Vervang deze elke PBT keer.

Spoel met de bereide primaire antilichaamoplossing en incubeer in de bevochtigingskamer bij vier graden Celsius gedurende de hele nacht tot de volgende dag. Spoel de gedissekeerde larven in eenmalig PBT gedurende 30 minuten door de buffer elke 10 minuten te vervangen. Bereid het secundaire antilichaam voor door het te verdunnen tot de juiste concentratie in de 5% BSA-oplossing.

Wikkel de bevochtigingskamer in folie, aangezien sommige secundaire antilichamen lichtgevoelig zijn. Incubeer de larven met de secundaire antilichaamoplossing gedurende een uur bij 25 °C. Wanneer de incubatie met het secundaire antilichaam is voltooid, spoel de larven gedurende 30 minuten in 1× PBT door de buffer elke 10 minuten te vervangen, en ga vervolgens over tot het monteren en visualiseren van de gedissekeerde larven voordat u de larve op het preparaat plaatst.

Bereid het objectglas voor door in het midden twee verticale lijnen nagellak aan te brengen, met een tussenruimte die groot genoeg is voor een dekglas, zoals weergegeven in het diagram. Laat de nagellak volledig drogen. Plaats, zodra de nagellak droog is, een druppel monteerbuffer in de ruimte tussen de verticale nagellaklijnen op het objectglas, zoals getoond in deze afbeelding.

Het preparaat is nu klaar om te worden gemonteerd. Haal de larven uit de oplossing nadat de laatste larve de PBT-behandeling heeft ondergaan. Spoel ze af en verwijder voorzichtig de laterale pinnen uit een larve.

Zorg ervoor dat de cuticula niet wordt gescheurd. Verwijder de twee resterende pinnen, pak de larve op met een pincet en plaats deze op het voorbereide preparaatglas. Controleer of de larve niet is omgedraaid en ventraal is georiënteerd.

Plaats voorzichtig met de zijde naar boven een dekglas erop en verzegel de randen met nagellak, zoals hier geïllustreerd. De larven zijn nu klaar voor visualisatie onder een fluorescentiemicroscoop. Deze representatieve afbeelding is van een wildtype-larve die is gekleurd met antilichamen tegen het synaptische blaasjes-eiwit, cystine string-eiwit.

De segmentale zenuwen van lava zijn gelijkmatig gekleurd. Hier is een lava-motorproteïne-mutant gekleurd met antilichamen tegen CSP. De segmentale zenuwen vertonen massale accumulaties die helder kleuren voor CSP.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de segmentale zenuwen die aan de hersenen vastzitten te behouden en de spieren intact te houden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van de dissectiemethode. Fixeer een immunostain third en begin met de larvale segmentale zenuwen om axonaal transport te bestuderen met behulp van een fluorescentiemicroscoop.