Uitdrukking, Wasmiddel oplosbaar, en zuivering van een Membraan Transporter, de MexB Multidrug Resistance Protein

Om het membraaneiwit Mex B te zuiveren, wordt Mex B eerst tot expressie gebracht in e coli met behulp van recombinante DNA-methoden. Vervolgens worden de membranen geïsoleerd en worden de membraaneiwitten gesolubiliseerd met een mild detergent. Het gesolubiliseerde membraaneiwit wordt gezuiverd via iMac en het eiwit wordt verder gezuiverd via gelfiltratiechromatografie.

De zuiveringsgraad van het eiwit wordt bepaald met behulp van SDS-polyacrylamidegelelektroforese. Hoewel deze procedure inzicht kan geven in transmembraantransporteurs voor multiresistentie, kan deze ook worden toegepast op andere membraaneiwitten. De procedures van vandaag zullen worden uitgevoerd door een promovendus uit mijn laboratorium. Voor deze procedure zal Mex B uit Pseudomonas aeruginosa worden gesubcloneerd in de expressievector pET 30b(+), zodat Mex B wordt tot expressie gebracht met een C-terminale His-tag. Begin 's avonds door vier LB-kanamycineculturen van 3 mL te inoculeren met verse transformanten of gebruik een bevroren stock; laat de culturen gedurende de nacht op een roller groeien bij 37 °C.

Gebruik de overnight-culturen om 150 milliliters LB te inoculeren die 30 micrograms per milliliter Kanamycine bevat. Laat de cultuur in de middag groeien bij 37 degrees Celsius op een schudapparaat. Gebruik de kleine cultuur om zes maal een liter XYT-medium te inoculeren dat 30 micrograms per milliliter bevat.

Kan mycine in fern back-kolven worden gebruikt? Gebruik 25 milliliter per cultuur voor een verdunning van 1 op 40. Kweek de culturen bij 37 °C tot ze een optische dichtheid bereiken.

600 van 0,4 tot 0,6, ongeveer 1,5 uur. Wanneer de culturen de juiste dichtheid hebben bereikt, wordt de eiwitexpressie geïnduceerd door 0,5 milliliters van één molar IPTG toe te voegen. Plaats alle kolven terug in de schudmachine en laat ze gedurende de nacht verder groeien bij 30 °C tot het oogsten van de bacteriën de volgende ochtend.

Haal de culturen uit de schudmachine en koel ze af. Om de cellen te oogsten, worden de culturen vervolgens overgebracht naar centrifugebuizen en 30 minuten gecentrifugeerd bij 4 °C met 5.000 tpm in een grootschalige centrifuge. Terwijl de cellen centrifugeren, wordt 100 ml celresuspensiebuffer aangevuld met DNAs protease-remmers en lysozym.

Vul daarnaast twee aliquots van de membraan Resus suspensiebuffer aan met protease-remmers, zoals weergegeven in deze tabel. Houd alle drie de oplossingen op ijs zodra de centrifugatie is voltooid. Resuspendeer de celpellets in 100 milliliters cel resus suspensiebuffer.

Extraheer vervolgens de cellen. De celsuspensie wordt in de French-drukcel geladen en de cel wordt op de French press geplaatst. Er wordt druk uitgeoefend tot deze 12.000 pounds per square inch bereikt.

Het ventiel wordt een heel klein beetje geopend, zodat de gebroken cellen er langzaam uitdruppelen. Het is belangrijk om het ventiel niet te ver open te zetten en de cellen er niet uit te laten spuiten, omdat ze dan met te weinig druk worden vrijgegeven en niet efficiënt zullen worden gebroken. Verzamel het cellysaat in een fles die koud op ijs wordt bewaard.

Leid de celoplossing opnieuw door een French pressure cell bij 12,000 pounds per square inch. Breng het cellysaat over naar SS 34 centrifugebuizen en centrifugeer om celresten te verwijderen bij 10,000 rotations per minute gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius in een SS 34 rotor. Vervolgens volgt het geklaarde lysaat.

Wordt gebruikt voor het voorbereiden van de membraanfractie. Breng het supernatant voorzichtig over in ti. 6 4, 7 0,5 ultracentrifugebuizen en centrifugeer deze in een TI 6 4 7 0,5 rotor bij 40.000 toeren per minuut gedurende 50 minuten bij vier graden Celsius.

Verwijder het supernatant. Gebruik een pipet om het pellet, dat de celmembranen bevat, voorzichtig te resuspenderen in ongeveer 25 milliliters membrane Resus suspensiebuffer. Breng de membraansuspensie over naar een schone centrifugebuis en centrifugeer opnieuw in een TI I 6 4 7 0.5 rotor op 40.000 toeren per minuut gedurende 50 minuten bij vier graden Celsius en resuspendeer het gewassen membraanpellet in 25 milliliters membrane Resus suspensiebuffer. Solubiliseer vervolgens de membraaneiwitten van de geresuspendeerde membranen in ongeveer 25 milliliters.

Voeg zes milliliters 10%DDM toe, zodat de uiteindelijke detergentconcentratie 2%DDM is; schud het mengsel zachtjes bij vier graden Celsius gedurende twee uur. Na de incubatie van twee uur in aanwezigheid van DDM wordt het mengsel gecentrifugeerd bij 40.000 toeren per minuut gedurende 40 minuten bij vier graden Celsius in de TI I 6 4 7 0.5 rotor, om de oplosbare eiwit-detergentcomplexen te scheiden van de onoplosbare eiwitten. Bewaar het supernatant dat de Mex B eiwit-detergentcomplexen bevat voor gebruik bij de zuivering. Meng het supernatant met de Mex B eiwit-detergentcomplexen met twee milliliters ionenmetaal-affiniteitskralen die zijn geëquilibreerd in Resus suspensiebuffer; incubeer dit gedurende één uur op een roller bij vier graden Celsius na binding van de eiwitten aan de hars.

Giet het mengsel in het lichaam van een zwaartekrachtstroomkolom en gooi de doorstroom weg. Was de kolom met 20 milliliters of 10 kolomvolumes iMac-bindings- en wasbuffer totdat het wassen van de kolom is voltooid. Elueer de gebonden eiwitten met 10 milliliters iMac-elutiebuffer.

Neem monsters van 10 µL van elke elutiefractie. Meng deze met 10 µL van een twee keer geconcentreerde SDS-monsterbuffer en analyseer op een 10% polyacrylamide-SDS-gel.

Schat de hoeveelheid en zuiverheid van mex B in elke fractie. Neem de fracties die de Mex B-eiwit-detergentcomplexen bevatten en concentreer deze in een spin-concentrator bij vier graden Celsius. Let erop dat het eiwit in deze stap niet neerslaat.

Voer meerdere korte centrifugaties uit en let op neerslag. Zuiver na elke centrifugatie de samengevoegde fracties met behulp van een gelfiltratiekolom. Pre-equilibreer een super rose 12 HL 30 over 10 kolom met 24 milliliters loopbuffer en wacht tot de basislijn stabiel is.

Spoel vervolgens de laadlus van het actor-systeem met running buffer. Filter de eiwitoplossing met een spuitfilter voordat u het eiwit op de kolom aanbrengt. Laad vervolgens tot 240 µL van de eiwitoplossing, met een eiwitconcentratie tot 5 mg/mL, op de kolom.

Spoel 1,5 kolomvolumes buffer door en verzamel fracties van 0,25 milliliter. De XB-proteïne-detergentcomplexen elueren als een piek bij een elutievolume van ongeveer 10 tot 15 milliliter. Neem monsters van vijf microliter van de piekfracties.

Meng elk monster in een verhouding van één op één met tweevoudige SDS-monsterbuffer. Analyseer de monsters op een 10% polyacrylamidegel om de hoeveelheid en zuiverheid van MexB in elke fractie te schatten en selecteer de fracties die zuiver MexB bevatten. Deze polyacrylamidegel werd geladen met geselecteerde fracties van de iMac-kolom en individuele fracties van de gelfiltratiekolom. Na de gelfiltratiekolom is het eiwit zuiver op de met Coomassie gekleurde polyacrylamidegel.

Een chromatogram van de gelfiltratiekolom laat de hoofdpiek zien van het eiwit-detergenscomplex dat uit de kolom elueert. De gemiddelde opbrengst van mxb-eiwit is ongeveer twee milligram per zes liter XYT-cultuur van 2X. Zodra men deze procedure beheerst, kan deze in acht uur worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe een membraaneiwit tot expressie kan worden gebracht, gesolubiliseerd en gezuiverd.