Visualisatie van mitochondriaal DNA-replicatie in afzonderlijke cellen door Edu signaalversterking

Het algemene doel van deze procedure is het labelen en visualiseren van M-T-D-N-A-replicatie in gekweekte neuronen. Dit wordt bereikt door de neuronen eerst gedurende twee tot 24 uur te incuberen met het thymidine-analogon EDU. De tweede stap van de procedure is het labelen van de EDU, die een alkyn bevat, met het fluorescente Oregon Green 488-azide via een kopergekatalyseerde covalente reactie.

De laatste stap van de procedure is het versterken van het organengroene signaal met een aramide-signaalversterkingsstap om het EDU te visualiseren dat is ingebouwd in nieuw gesynthetiseerd MT-DNA. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die MT-DNA-replicatie in specifieke subcellulaire compartimenten van neuronen aantonen door de combinatie van click-EDU-chemie en daaropvolgende tear-mind-signaalversterking. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals BRDU-labeling is dat EDU-labeling eenvoudiger en milder is, wat aanvullende immunofluorescente kleuring van neuronale markers mogelijk maakt.

Deze methode kan cruciale vragen beantwoorden over de regulatie van het aantal mitochondriën, zoals de manier waarop neuronen voldoen aan veranderende energievraag in hun subcellulaire compartimenten, waaronder cellichamen, axonen, dendrieten en synaptische terminals. Zo kan deze methode inzicht bieden in de mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathogenese van verschillende mitochondriële neurologische aandoeningen, waaronder neuropathie en neurodegeneratie. Belangrijk is dat de methode ook kan worden toegepast op andere systemen waarbij veranderingen in het aantal kopieën van mitochondriaal DNA waarschijnlijk de pathogenese van de ziekte toeliggend zijn, waaronder geneesmiddeltoxiciteit, kanker en veroudering.

Deze video demonstreert hoe men pas gesynthetiseerd mitochondriaal DNA, afgekort M-T-D-N-A, kan labelen in neuronen van het dorsale wortelganglion die zijn gekweekt op steriele glazen dekglasjes van 12 millimeter. Verdun in een kweekplaat met 24 putjes de 10 millimolaire stock van 5-ethynyl-2'-deoxyuridine, afgekort EDU, uit de Click-iT EDU Microplate assay kit in een verhouding van 1:100 in kweekmedium om een 10X EDU-stock te verkrijgen. De 10X EDU-stock wordt vervolgens direct aan het medium in elke putje toegevoegd. Incubeer de behandelde neuronen gedurende 2 tot 24 uur bij 37 °C en 5% CO2 in een zuurkast.

Fixeer de neuronen in 2% Paraformaldehyde gedurende 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur. Was tweemaal in 1x PBS gedurende twee tot vijf minuten per wasbeurt. De gefixeerde neuronen kunnen worden bewaard in verse 1x PBS bij vier graden Celsius voor maximaal één maand.

Bereid een vochtkamer voor zoals beschreven in de bijbehorende tekst. Gebruik een pincet met fijne punten om 28 gefixeerde dekglasjes, inclusief positieve en negatieve EDU-controles, over te brengen naar vellen hydrofoob paraform M in de vochtkamer. Breng 200 tot 300 µL 1X PBS opnieuw aan om het oppervlak van elk dekglasje te bedekken.

Bereid de click-it assaykit voor zoals beschreven in de tekst en de instructies van de fabrikant om mitochondriaal DNA te labelen. Voeg 75 tot 80 µL van een permeabilisatieloplossing met 0,1% Triton X in 1x PBS toe aan elk dekglas en incubeer dit gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik een bulb-transferpipet met een 200 µL tip aan het uiteinde om de vloeistof voorzichtig te verwijderen zonder cellen te verliezen.

Gebruik een bulbpipet om het dekglas voorzichtig te vullen. Spoel met 200 tot 300 µL 1x PBS om de vorige oplossing grondig uit te wassen. Was elk dekglas twee keer.

Pipetteer 75 tot 80 µL verse 1% waterstofperoxide in 1X PBS op elk dekglas. Incubeer afgedekt gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om endogene peroxidase-activiteit te blokkeren. Spoel twee keer met 1X PBS zoals voorheen en bereid vers de click-reactiecocktail voor zoals beschreven in de begeleidende tekst.

Pipette de vloeistof op en neer om te mengen. Vortex niet. Postfixeer de neuronen met 75 tot 80 µL click-at-EDU fixatief per dekglas en incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur. Verdun tijdens de postfix-incubatie de reactiecocktail met een gelijk volume click-at-EDU fixatief.

Voeg het reactiemengsel toe aan elk dekglasdeksel om bescherming tegen licht te bieden en laat dit 25 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Verwijder voorzichtig het reactiemengsel en was tweemaal met verdunde 1x blokkeringsbuffer onder een epifluorescentiemicroscoop. Controleer op Orgon Green-kleuring in de kernen wanneer de EdU-kleuring is voltooid.

Begin de termite signal amplification (TSA) door 1% TSA-blokkeeroplossing aan elk dekglas toe te voegen en 30 minuten bij kamertemperatuur te incuberen. Centrifugeer de voorraad anti-green horse radish peroxidase-geconjugeerde antilichamen kortstondig. Bereid de TSA twee tot 24 uur vooraf voor; verdun het primaire antilichaam 1:300 in TSA-blokkeeroplossing en meng door te keren of te pipetteren, maar vortexeer niet. Voeg 75 µL toe aan elk dekglas en incubeer overnight bij 4 °C.

Spoel de volgende dag drie keer met 1x PBS bij kamertemperatuur. Incubeer de dekglasjes in de laatste wasstap nog eens 30 tot 60 minuten om ervoor te zorgen dat ongebonden primaire antilichamen zijn verwijderd. Bereid de IDE-reactie direct voor gebruik voor volgens het tekstgedeelte van dit protocol.

Incubeer de dekglasjes met de IDE-reactie gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Was drie keer met XPBS, waarbij de laatste wasstap 30 tot 60 minuten duurt, zoals voorheen onder de microscoop. Controleer op MT-DNA-labeling en monteer succesvol gekleurde neuronen op glazen objectglazen met een ANTIFA-montagemedium dat DPI bevat; hier worden representatieve differential interference contrast-beelden getoond van embryonale en volwassen neuronen uit het dorsaal wortelganglion die gewoonlijk voor analyse worden gebruikt.

Deze schematische diagrammen representeren de procedure voor het labelen van EDU in MTD NA met een groen fluorescent signaal. Mitotisch actieve F 11 neuroblastoomcellen dienen als positieve controle en illustreren het labelingspatroon van EDU dat is ingebouwd in nucleair en mitochondriaal DNA in deze representatieve fluorescentiebeelden over een bright field-opname. De groene punctate signalen tonen het versterkte EDU-signaal dat is ingebouwd in nieuw gesynthetiseerde M-D-D-N-A van zowel embryonale als volwassen neuronen van het dorsale wortelganglion.

De EDU-labelingsprocedure maakt een daaropvolgende immunofluorescente kleuring van neuronale markers, zoals neurofilament in het rood, mogelijk. Deze schema's representeren de procedure voor het labelen van EDU en MTD NA met een rood fluorescent signaal. Mitotisch actieve F 11 neuroblastoomcellen dienen als positieve controle en illustreren het labelingspatroon van EDU dat is ingebouwd in het nucleaire en mitochondriale DNA.

Dit schema stelt de procedure voor het labelen van BRDU in nieuw gesynthetiseerd M-T-D-N-A met een groen of rood fluorescent signaal voor. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om controles uit te voeren met mitotisch actieve cellen om de succesvolle EDU-labeling en celkernen te controleren voordat men overgaat tot de amplificatiestappen om de MT DNA-labeling volgens deze procedure te visualiseren. Andere methoden, zoals standaard immunofluorescentie, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe de synthese van mitochondriaal DNA wordt gereguleerd in specifieke subpopulaties van neuronen of neuronale compartimenten. Door de ontwikkeling van deze techniek wordt de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de neurobiologie om de regulatie van het aantal mitochondriën te onderzoeken in cultuurmodellen van zowel normale fysiologie als cultuurmodellen die ziektebeelden simuleren.

Neurologische toestanden.