Voorbereiding van de muis hypofyse Immunogeen voor de inductie van experimentele auto-immune Hypophysitis

Auto-immuun hypofyisitis wordt gekenmerkt door een vergroting van de hypofyse en een tekort aan één of meer hypofysehormonen. De veroorzakende autoantigenen blijven onbekend. Hier wordt een protocol gedemonstreerd voor het prepareren van eiwitten uit de hypofyse van muizen voor gebruik bij het bestuderen van deze ziekte.

Eerst worden de hypofysen geïsoleerd uit geëuthanaseerde muizen. De hypofysen worden vervolgens gehomogeniseerd om de cellen mechanisch af te breken en cytosolische eiwitten vrij te maken. Het homogenaat wordt geklaard door middel van centrifugatie bij lage snelheid en beoordeeld op kwantiteit via een colorimetrische BCA-assay en op kwaliteit via polyacrylamidegelelektroforese.

Ten slotte wordt het waterige eiwithomogenaat gemengd met een oliehoudend adjuvans. Dit mengsel wordt vervolgens in muizen geïnjecteerd om een muismodel te creëren dat lijkt op auto-immuun hypofysitis. Zoals getoond in de begeleidende video, zijn er vier technieken beschreven om hypofysitis bij proefdieren op te wekken.

De in dit artikel gepresenteerde techniek, namelijk de injectie van een mengsel van hypofyse-eiwitten als influenzajuvans, is de oudste methode en stamt uit de jaren 1960. Andere benaderingen waren de injectie van oplosbare glycoproteïnen van het rubellavirus in 1992, de stereotactische injectie van een adenovirus direct in de hypofyse in 2002, en de transplantatie van de hypofyse van de ene rattenstam onder het nierkapsel van een andere rattenstam in 2010. Het belangrijkste voordeel van de adjuvantbenadering van Florence is dat deze tegenwoordig minder invasief is, consistenter is en bovenal nauwkeuriger is in het induceren van een ziekte die sterk lijkt op het menselijke equivalent.

Hoewel de techniek met vreemd adjuvans al sinds de jaren 60 wordt gerapporteerd, bleek deze weinig effectief voor de inductie van hypofysitis. Toen ik begon met mijn promotieonderzoek, kon ik met het gepubliceerde protocol voor vreemd adjuvans slechts bescheiden gevallen en ernst van hypofysitis bewerkstelligen. De resultaten verbeterden aanzienlijk toen ik het idee kreeg om de hoeveelheid pitu-eiwitten in de EM-emulsie met een factor tien te verhogen.

Hoewel deze methoden inzicht kunnen bieden in de pathogenese van auto-immuun hypofyisitis, kunnen ze ook worden gebruikt om andere auto-immuunziekten te bestuderen waarvan de auto-antigenen nog moeten worden geïdentificeerd. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methoden vooral moeite hebben met de laatste stap, het bereiden van de marge, omdat dit handvaardigheid, tijd en toewijding vereist. Een visuele demonstratie is daarom cruciaal om te begrijpen hoe een juiste emulsie moet worden bereid.

De implicaties van deze techniek reiken verder dan het veld van auto-immuniteit. De kennis over hoe het antigeen voor immunisatie moet worden geprepareerd, kan ook worden toegepast bij de productie van monoclonale antilichamen of voor het testen van nieuwe vaccins. Deze techniek zal worden gedemonstreerd door S Zoo heroic Ura en Mayland al gato uit mijn laboratorium.

De hypofyse van de muis is een cilindervormige klier die zich aan de basis van de schedel bevindt in een verdieping van het spiekenbeen, genaamd de sella turcica. De klier wordt lateraal begrensd door de nervus trigeminus en anterieur door het chiasma opticum. Ze bestaat uit een grotere voorlob en kleinere tussen- en achterlobben.

Om de hypofyse te isoleren, gebruikt u een schaar om de geëuthanaseerde muis te onthoofden, waarna u parallelle sneden maakt van de achterkant naar de voorkant van de schedel. Til de hersenen op en klap deze naar achteren om de hypofyse bloot te leggen, die verschijnt als een cilinder binnen een gelijkbenige driehoek, waarbij de hypofyse de basis vormt, de nervi trigemini de zijden zijn en het chiasma opticum de top vormt.

Omcirkel de klier met de punten van gesloten pincetten om de omringende meninges door te breken. Pak vervolgens met fijne pincetten de hypofyse uit de sella turcica en plaats deze in een plastic buisje op droogijs. Verzamel voor één preparatie 300 muizenhypofysen.

Deze collectie vereist ongeveer negen personuren. Zodra de collectie is voltooid, worden de hypofysen bewaard bij -80 °C tot ze nodig zijn. Plaats een Falcon-buis van 15 ml in een ijsbad.

Voeg 250 µL homogenisatiebuffer toe aan de buis. Voeg voor elke 100 hypofysen die vlak voor de homogenisatie zijn verzameld, de muishypofysen toe aan de buffer. Plaats vervolgens de tip van de Polytron-homogenisator, een generator met een diameter van 5 mm, op de bodem van de Falcon-buis met de muishypofysen en buffer, en homogeniseer op maximale snelheid gedurende 30 seconden.

Beweeg de buis voorzichtig op en neer terwijl deze op ijs blijft. Laat het homogenaat vervolgens één minuut op ijs rusten. Herhaal de homogenisatie- en koelingsstappen nog twee keer.

Deze milde homogenisatie moet de cellen openbreken en de eiwitten vrijmaken zonder de kernen te beschadigen. Centrifugeer het homogenisatieproduct op lage snelheid, ongeveer 1000 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius, om de kernen, onbeschadigd weefsel en onoplosbare materialen zoals bindweefsel en gedenatureerde eiwitcomplexen te laten sedimenteren. Let erop dat het pellet niet wordt verstoord.

Breng de SNA, nu postnucleaire supernatant of PNS genoemd, over naar een nieuwe Falcon-buis voor bewaring. Houd de PNS op ijs en resuspendeer het pellet met hetzelfde volume homogenisatiebuffer als eerder; homogeniseer en centrifugeer zoals voorheen. Nadat de twee PNS-monsters zijn samengevoegd, verdeelt u de oplossing over verschillende microtubussen.

Bewaar de microcentrifugebuisjes bij -80 °C tot ze nodig zijn. Deze eiwitpreparatie is stabiel bij -80 °C, maar verliest geleidelijk haar potentie. Daarom wordt aanbevolen om deze binnen zes maanden na de bereiding te gebruiken.

Bewaar één klein aliquot PNS om de eiwitopbrengst en -concentratie te bepalen met de biy-zuurassay. Bepaal vervolgens de eiwitkwaliteit via gelelektroforese van 300 muizenhypofysen, met een gemiddeld totaal gewicht van ongeveer 570 milligrams. Verwacht een opbrengst van 60 milligrams hypofyseeiwitten of één milligram eiwit per 10 milligrams weefsel.

De proteïneconcentratie is doorgaans ongeveer 40 mg/mL. Het hier gegeven voorbeeld is bedoeld voor de immunisatie van 10 muizen. Er wordt gepland om elke muis 100 µL emulsie toe te dienen die één mg hypofyseproteïne bevat; rekening houdend met twee extra muizen voor materiaalverlies tijdens de bereiding, worden er hier 12 mg proteïne-emulsie klaargemaakt.

Begin met het snel ontdooien van de bevroren eiwit-aliquots door ze in uw handen op te warmen. Pas de eiwitconcentratie aan naar 20 mg/mL met PBS. Trek vervolgens 600 µL van het hypofyse-eiwitextract, overeenkomend met 12 mg, op in een 2,5 mL Gas Tite Hamilton-spuit en resuspendeer dit in compleet FRONS-adjuvans of CFA dat 5 mg/mL hitte-gedode mycobacterium tuberculosis bevat door het handmatig te schudden.

Trek vervolgens 600 µL van de CFA op in een andere Hamilton-spuit van 2,5 mL. Bevestig en zet een micro-emulgerende naald van 22 gauge vast op de met CFA gevulde spuit. Druk de zuiger langzaam in zodat de naald met CFA wordt gevuld.

Bevestig vervolgens het andere uiteinde van de naald aan de andere spuit die is gevuld met pituitary proteinextract en zet deze goed vast. Voorkom dat er luchtbellen in de spuiten achterblijven. Duw de zuiger van de CFA-spuit langzaam in om het oliecomponent in het waterige pituitary extract te persen, zodat er slechts een kleine hoeveelheid wordt gemengd.

Duw vervolgens de zuiger van de spuit met hypofyse-extract terug in de CFA-spuit. Herhaal deze handeling om de hoeveelheid gemengd materiaal geleidelijk te verhogen totdat de gehele inhoud is gemengd. Dit witachtige en gelijkmatig verdeelde materiaal vormt de water-in-olie-emulsie.

Zodra de emulsie is gevormd, wordt de volledige heen-en-weergaande cyclus ten minste 500 keer herhaald; na de laatste cyclus bevatten de spuiten een één-op-één water- en olie-emulsie waarbij de concentratie hypofyse-eiwit nu 10 mg/mL is. De emulsie is nu klaar voor gebruik. Om de kwaliteit van de emulsie te testen, wordt één druppel ervan in een bekerglas met water gevoegd. Als de emulsie correct is bereid, blijft de druppel compact en strak aan het oppervlak.

Als de emulsie van slechte kwaliteit is, zal deze uitspreiden en uiteenvallen in kleinere druppels. De emulsie wordt op de dag van bereiding geïnjecteerd in SJL-muizen om experimentele auto-immuunhypofyisitis op te wekken. Dit protocol wordt gedetailleerd beschreven in de bijbehorende jo of vertical.

Zodra de hypofyse is verzameld en de technieken onder de knie zijn, kan de eiwitextractie in één uur worden uitgevoerd, mits er snel en op ijs wordt gewerkt. Tijdens deze stap, tijdens de bereiding van de immersie, is ongeveer één uur nodig. Denk eraan om in de initiële mengfase na de ontwikkeling langzaam en geduldig te werken.

Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van autoimmuniteit om de mechanismen te onderzoeken waarlangs autoreactieve lymfocyten het doelorgaan herkennen en infiltreren. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u een eiwitextract uit de hypofyse van een muis bereidt en hoe u dit mengt met Crohn's adjuvans om een emulsie te maken die klaar is voor gebruik als immunogeen. Vergeet niet dat het werken met spuiten en compleet adjuvans, dat geïnactiveerde en gedroogde microbacteriële tuberculosis bevat, gevaarlijk kan zijn als u zichzelf per ongeluk prikt.

Gebruik daarom altijd handschoenen en voer de naalden op de juiste wijze af tijdens het uitvoeren van deze procedure.