Het kwantificeren van Synapsen: een immunocytochemie-gebaseerde test te Synapse Number Kwantificeer

Een van de belangrijkste doelen in de neurowetenschappen is het begrijpen van de moleculaire signalen die de vroege stadia van synapsvorming aansturen. Daarom is het noodzakelijk geworden om objectieve benaderingen te ontwikkelen om veranderingen in de synaptische connectiviteit te kwantificeren. Om het aantal synapsen in diverse experimentele preparaten te kwantificeren, worden gecultiveerde neuronen of cryosecties van hersenweefsel gekleurd met selectieve presynaptische en postsynaptische markers om de punten van synaptisch contact tussen neuronen te labelen.

De cellen of het weefsel worden vervolgens gefotografeerd met een fluorescentiemicroscoop, waarbij eight-bit beelden worden verkregen voor elk van de kanalen die overeenkomen met de twee immunohistochemische markers. De beelden worden geanalyseerd met ImageJ 1.29 in combinatie met de puncta analyzer. Om de mate van colocalisatie tussen pre- en postsynaptische markers te bepalen, kunnen de colocalisatiepunten worden gebruikt om het aantal synapsen in het preparaat vast te stellen.

Het belangrijkste voordeel van de hier beschreven techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals elektronenmicroscopie, is dat de synapse-assay een veel hogere doorvoer mogelijk maakt voor de analyse en kwantificering van het aantal synapsen. De belangrijkste implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de diagnose en therapie van klinische aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer, epilepsie of autisme, waarbij abnormaliteiten in de synaptische connectiviteit zijn geïmpliceerd als basis voor de onderliggende pathologie. Deze techniek kan worden gebruikt om interventievormen te identificeren die de tekortkomingen kunnen verminderen of verbeteren in het vermogen van aangetaste neuronen om synapsen met elkaar te vormen.

Hoewel deze methode nuttig is voor het bestuderen van de hersenontwikkeling, kan deze ook worden toegepast op andere modelorganismen of organsystemen waarin u geïnteresseerd bent om het aantal cel-celcontacten te bestuderen of te kwantificeren, mits u in staat bent om elke tegenoverliggende zijde van elke contactplaats selectief te labelen. Bereid neuronale culturen voor door rat retinal ganglion cells, gezuiverd uit ratnetvliezen geoogst van P five to seven dieren, uit te plaatten op glazen dekglasjes gecoat met poly-L-lysine. In een 24-well plaat krijgen de cellen drie tot vijf dagen vóór transfectie de gelegenheid om te groeien bij 37 °C.

Incubeer de cellen na transfectie nog zeven tot acht dagen om de synapsen te laten ontwikkelen zodra de geplaatste cellen voldoende zijn gerijpt. Verwijder het kweekmedium uit de wells en voeg aan elke well 500 µL voorverwarmde, 4% paraformaldehyde toe en fixeer ze gedurende zeven minuten. Spoel de cellen na de fixatie drie keer met fosfaatgebufferde zoutoplossing bij kamertemperatuur.

Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de cellen in de wells nooit uitdrogen. Zodra een buffer uit een well is verwijderd, moet deze prompt worden vervangen door de volgende buffer. Bereid blokkeringsbuffer voor die 50% normaal geiten serum en 0,2% Triton X 100 bevat.

Nadat de PBS uit elke put is verwijderd, worden 200 µL van de blokkeerbuffer aan elke put toegevoegd en wordt er gedurende 30 minuten geblokkeerd bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de blokkeerbuffer en spoel drie keer met PBS. Bereid een verdunning van het primaire antilichaam voor in een oplossing van 90% antilichaambuffer en 10% NGS, met het gewenste paar pre- en postsynaptische antilichamen.

Hier worden een konijnen-anti-synapsine, een presynaptische marker, en een muis-anti-homer, een postsynaptische marker, gebruikt. Centrifugeer de verdunning van het primaire antilichaam vijf minuten op maximale snelheid in een benchtop-centrifuge om eventuele neergeslagen antilichamen te verwijderen, voeg vervolgens 200 µL primaire antilichaamoplossing toe aan elke put. Plaats de plaat in een bevochtigde container om uitdroging van de primaire oplossing te voorkomen.

Incubeer overnacht bij vier graden Celsius na de incubatie met het primaire antilichaam. Spoel elke well drie keer. Voeg 200 microliters van de juiste secundaire antilichamen toe, verdund 1:1000 in de bereide antilichaambuffer met 10% NGS, met PBS.

Plaats de schaal, zoals voorheen, in de bevochtigingskamer en incubeer deze na de incubatie met de secundaire antilichamen gedurende twee uur bij kamertemperatuur in het donker. Spoel elke put drie tot vier keer met PBS. Breng een druppel vector shield montage medium met DPI aan op een glasplaatje.

Keer vervolgens het dekglas met de cellen om op de druppel om te monteren. Breng tot slot transparante nagellak aan rond de randen van het dekglas. Zorg ervoor dat het dekglas tijdens het aanbrengen niet wordt verschoven of bewogen.

Omdat dit de cellen zal delen, moeten de slides minimaal 30 minuten drogen op een droge, donkere plaats. Hier wordt de beeldvorming uitgevoerd met een Zeiss Axio Imager fluorescentiemicroscoop, uitgerust met geschikte filtersets en een 63× olie-immersieobjectief. Plaats een slide met niet-getransfecteerde cellen op de microscopentafel.

Gebruik de DPI-filterset om de celkernen te visualiseren en selecteer cellen die zich op een afstand van ten minste twee celdiameters van hun dichtstbijzijnde buren bevinden. Het gebruik van DPI voor deze stap helpt bij het vermijden van bias en waarborgt de willekeur van de celselectie. Maak voor elke geselecteerde cel eight-bit beelden met de juiste filtersets, in dit geval GFP en Texas Red.

De overgelegde pseudo-gekleurde afbeelding moet pre- en postsynaptische markers respectievelijk in rood en groen tonen. Plaats vervolgens een objectglas met getransfecteerde cellen op de microscooptafel. In dit geval zijn de cellen getransfecteerd met een TD tomato-expressievector.

Gebruik deze marker om cellen te selecteren zoals eerder beschreven. Maak voor elke geselecteerde cel acht pit-afbeeldingen met de juiste filtersets, in dit geval GFP, Texas Red en Sci five. De supergeponeerde pseudogekleurde afbeelding moet de postsynaptische markers in rood, groen en blauw bevatten.

Hier wordt het programma puncture analyzer gebruikt voor de kwantificering van colocaliserende synaptische puncta. De Puncta analyzer-plugin is geschreven door Barry Walk en is op aanvraag beschikbaar in image J 1.26. Open een van de verzamelde afbeeldingen.

Gebruik de cirkelvormige selectietool om een gebied te selecteren met een straal van ongeveer één celdiameter rond de SOR van belang. Nadat het interessegebied is geselecteerd, gaat u naar het plug-insmenu en selecteert u 'puncture analyzer' in het venster met analyse-opties dat verschijnt. Selecteer het rode kanaal en het groene kanaal. Selecteer vervolgens 'subtract background' en bepaal het resultatenbestand.

Klik op oké. Definieer vervolgens een locatie om de resultaten op op te slaan. In het venster dat verschijnt, kunnen deze resultaten worden geëxporteerd naar Excel voor verdere analyse.

Zorg vervolgens dat een rolling ball radius van 50 is geselecteerd en vink de optie voor een witte achtergrond uit. Deze aanpassing is niet vereist, maar wordt vaak preferred door gebruikers van de applicatie. Klik voor een eenvoudigere visualisatie op ok.

Er verschijnt een nieuw venster naast een masker dat overeenkomt met de afbeelding van het rode kanaal. Pas de drempelwaarde aan tot het rode masker zo nauwkeurig mogelijk overeenkomt met zoveel mogelijk afzonderlijke puncties. Klik op 'done' zonder te veel ruis te introduceren.

Stel de minimale punctu-grootte in op vier pixels. Pas verder niets aan. Klik op oké.

Herhaal de vorige stap nu voor het groene kanaal. Nadat dit is gedaan voor het groene kanaal, zal de plug-in kwantificeringen leveren die overeenkomen met de puncta in elk kanaal afzonderlijk en de colocaliserende puncta tussen de twee kanalen. De hier getoonde synaps-assay kan worden toegepast op cryosneden van de hersenen en op elk ander zenuwstelselweefsel, zoals het ruggenmerg of het netvlies.

Mits er een geschikt pre- en postsynaptisch markeerpaar beschikbaar is. Begin met het oogsten van hersenweefsel van een muis die is geëuthanaseerd door exsanguinatie en perfusie met PBS. Plaats de gehele hersenen gedurende de nacht bij vier graden Celsius in 4% paraformaldehyde in PBS.

Spoel de hersenen drie keer met PBS. Cryoprotegeer de hersenen door ze in 30% sucrose in PBS te plaatsen.

Het weefsel zal aanvankelijk drijven; bewaar dit bij vier graden Celsius totdat het weefsel naar de bodem zinkt. Op dat moment is de cryoprotectie voltooid. Bedrijf vervolgens de hersenen in de gewenste oriëntatie voor sectieen in een twee-op-een oplossing van 20% sucrose met OCT en PBS.

Bijvoorbeeld sagittaal of coronaal. Plaats vervolgens een vlak metalen oppervlak bovenop een bak met droogijs. Plaats het ingebedde brein hierop om het te bevriezen. Zodra het bevroren is, brengt u het brein over in een vrieszak en bewaart u deze bij minus 80 graden Celsius tot een jaar voor het maken van coupes.

Snijd het weefsel met een cryostaat in secties van 12 tot 16 micron en monteer deze op objectglazen. Droog vervolgens de glazen door ze in een oven van 37 °C te plaatsen. Spoel ze daarna drie keer met PBS om resterende OCT te verwijderen.

Een paraffinepen wordt gebruikt om een hydrofoob barrière rond het objectglas te creëren, waarna blokkeringsbuffer op het glas wordt aangebracht; de paraffineborder voorkomt dat deze van het glas afstroomt. Plaats de objectglazen gedurende één uur bij kamertemperatuur in 20% normaal geiten serum in PBS om de aspecifieke binding te blokkeren. Plaats vervolgens de coupes in primaire antilichamen, verdund in PBS met 0,3% triton en 10% normaal geiten serum.

Hier wordt konijn anti-PSD 95 gebruikt om glutamaterge, postsynaptische compartimenten te labelen en cavia anti-vGlu2 wordt gebruikt om glutamaterge presynaptische terminals te labelen. Plaats de coupes bij 4 °C en incubeer deze gedurende 36 tot 60 uur. Was na de incubatie de primaire antistoffen weg door de coupes drie keer gedurende 15 minuten in PBS onder te dompelen.

Zorg er na deze stap voor dat de objectglaasjes worden beschermd tegen direct licht. Breng secundaire antilichamen aan, verdund 1:200 in PBS met 0,3% triton en 10% normaal geiten serum. Gebruik hier geiten anti-guineapigment.

Alexa 488 en geiten anti-konijn Alexa 594 worden gebruikt. Incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur in het donker.

Was de objectglazen door ze vier keer gedurende 15 minuten in PBS onder te dompelen voor het inklissen. Voeg met een pipetteersysteem kleine druppels Vector Shield inklismiddel toe en dek de objectglazen af met dekglasjes. Breng nagellak aan om verschuivingen van de dekglasjes te voorkomen.

De beeldvorming van weefselcoupes moet worden uitgevoerd met een confocale microscoop met geschikte lasers, waarbij voor elk coupebeeld een 63-voudige olie-immersieobjectief wordt gebruikt; seriële optische coupes met intervallen van 0,33 micron over een totale diepte van vijf micron, voor een totaal van 15 optische coupes. Er moeten minstens drie coupes van elk dier worden gefotografeerd en er moeten minstens drie dieren worden opgenomen per gegeven experimentele conditie. Genereer maximumintensiteitsprojecties uit groepen van drie opeenvolgende coupes, wat resulteert in vijf projecties die elk één micron diepte vertegenwoordigen.

Deze worden gekwantificeerd met Image J zoals beschreven voor RG Cs, met een aangepaste ROI om het aantal gevormde synapsen in afwezigheid van astrocyten te bepalen. Immunochemie werd uitgevoerd op gedissocieerde rgc behandeld met basaal groeimedium, met behulp van antilichamen tegen bassoon (weergegeven in rood) en homer (weergegeven in groen), zoals verwacht. Er worden zeer weinig punten van synaptische colocalisatie waargenomen. Om het effect van door astrocyten gesecreteerde moleculen op het aantal gevormde synapsen te bepalen, werden in vitro gedissocieerde RG Cs elke drie dagen behandeld met geconditioneerd medium van muisastrocyten gedurende in totaal 12 dagen voorafgaand aan de kleuring.

In dit neuron waren talrijke synapsen zichtbaar, maar soon wordt in rood weergegeven. Homer wordt in groen weergegeven. Gedissocieerde RDC's getransfecteerd met cytoplasmatisch Lee dat TD tomato tot expressie bracht, werden behandeld met enkel basaal groeimedium. Synapsen zijn niet zichtbaar.

TD-tomaat is blauw gekleurd en de synaps is rood gekleurd. Er is zeer weinig signaal zichtbaar voor de postsynaptische marker homer, weergegeven in het groen. Wanneer dezelfde cellen chronisch worden behandeld met geconditioneerd medium van rattenastrocyten, zijn er veel synapsen zichtbaar.

TD tomaat is hier in blauw, synapsine in rood en homer in groen. Er wordt een gezuiverde RGC getoond die is behandeld met astrocyten-geconditioneerd medium en is gekleurd voor presynaptische markers in rood en postsynaptische homer-markers in groen. De threshold-masks gegenereerd met de Puncta Analyzer komen overeen met de twee aanwezige kanalen. Na het identificeren van colocalisatiepunten geeft de Puncta Analyzer een grafische weergave van deze punten weer.

Een numerieke output wordt geleverd door de puncta-analyser, die het aantal discrete puncta aangeeft dat in beide kanalen is geïdentificeerd en voor punten van colocalisatie. De gegevens voortvloeiend uit de analyse van dit neuron illustreren het vermogen van door astrocyten uitgescheiden moleculen om de vorming van synapsen te bevorderen; dit wordt hier weergegeven als een synaps-assay waarin de colocalisatie van pre- en postsynaptische immunohistochemische kleuringen is gekwantificeerd om de potentiering van astrocyten-geïnduceerde synapsvorming aan te tonen door overexpressie van de neuronale receptor voor het belangrijke door astrocyten uitgescheiden synaptogene molecuul thrombospondine. In deze figuur wordt het gemiddelde aantal synapsen per neuron getoond dat chronisch is behandeld met basale groeimedia, gm, of met astrocyten-geconditioneerde media.

A-C-M-A-C-M bevordert de synaptische vorming in retinale ganglioncellen die de thrombosponine-receptor overexpresseren sterker dan in cellen die een lege vector overexpresseren. Om de synaptische dichtheid in de superieure colliculus van de muis te kwantificeren, werden pre- en postsynaptische compartimenten afzonderlijk gelabeld met behulp van compartimentspecifieke immunohistochemische markers. Zoals hier getoond, was er een toename in het aantal synapsen van postnatale dag zeven tot P 14.

Dit illustreert de toename van het aantal synapsen in de superior colliculus gedurende dit ontwikkelingsvenster. Zodra de methode onder de knie is, kan dit protocol in ongeveer twee dagen worden voltooid voor gedissocieerde neuronale culturen en in ongeveer vijf dagen voor hersensecties, beginnend bij de winning uit het dier volgens deze procedure. Andere methoden, zoals elektrofysiologie en elektronenmicroscopie, worden gebruikt om te verifiëren dat de veranderingen in het aantal synapsen respectievelijk wijerspiegelen op veranderingen in zowel functionele synapsen als ultrastructureel normale synapsen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u immunohistochemie op uw experimentele preparaat kunt toepassen om het aantal synapsen te kwantificeren. Dit protocol beschrijft in detail hoe u compartimentspecifieke antilichamen gebruikt om pre- en postsynaptische compartimenten selectief te labelen. In deze context definiëren we synapsen als punten van colocalisatie tussen de signalen die zijn verkregen van elk van deze markers.