Agar-Block microkosmos voor de gecontroleerde Plant Tissue Ontleding door Aerobic Fungi

Het algemene doel van deze procedure is om een aerobe houtafbrekende schimmel te inoculeren in een petrischaal-microkosmos waarin het vochtgehalte van het hout en exogene substraten strikt worden gecontroleerd. Dit wordt bereikt door eerst microkosmossen voor te bereiden met exacte volumes van bekende media. Vervolgens worden het af te breken hout en eventuele exogene vaste substraten geassembleerd bovenop een plastic rooster op het agar-oppervlak, zonder dat de substraten elkaar raken.

Het microkosmos wordt vervolgens geïnoculeerd en geïncubeerd met de testschimmel. Na de incubatie worden de houtblokken geoogst om het massaverlies te bepalen en de weefsels voor analyses voor te bereiden. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de mate van houtbiodegradatie en de rol van exogene elementbronnen aantonen via massaverliesmetingen, observaties van de myceliummorfologie en gerichte elementanalyses zoals inductief gekoppelde plasmaspectroscopie.

Hallo, mijn naam is Brooke Jacobson van het laboratorium van Dr. Jonathan Schilling van de afdeling Bioproducts and Biosystems Engineering aan de University of Minnesota. Vandaag gaan we u een procedure laten zien voor het gebruik van petrischalen als micro-omgevingen voor de afbraak van planteweefsel door aerobe schimmels. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de mechanismen van lignocellulose-afbraak door schimmels te bestuderen.

Lignocellulose is het planteweefsel dat bestaat uit lignine, cellulose en hemicellulose. Het weefsel dat wij het meest bestuderen is hout; fouten met de minder technische aspecten van het ontwerp van het boorblok zijn de meest voorkomende oorzaken van falen en de belangrijkste bronnen van variabiliteit tussen studies, waardoor een videopublicatie van onze opstelling van het boorblok nuttig is. We weten uit ervaring dat deze procedure kwalitatief hoogwaardige resultaten met een lage variabiliteit oplevert.

Laten we beginnen. Gebruik voor deze experimenten Petrischalen die één centimeter dieper zijn dan gebruikelijke Petrischalen om de vrije ruimte boven het houtblok in het microcosmos te vergroten.

Begin de preparatie van het microcosmos door voldoende medium te maken voor 20 milliliter per Petri-schaal, vrij van calcium en ijzer. Voeg 15 gram agar toe aan een maatkolf van 500 milliliter die ongeveer 400 milliliter gedeïoniseerd water bevat, aangevuld met supplementen. Gebruik eerder bereide stamoplossingen om micronutriënten aan het mengsel toe te voegen.

Zodra de voedingsstoffen zijn toegevoegd, vult u de maatkolf aan tot de lijn van 500 milliliter. Breng het medium vervolgens over naar een kolf van 1000 milliliter. Autoclaveer dit bij 121 degrees Celsius en 16 PSI gedurende 20 minuten.

Zorg ervoor dat het volume van 500 milliliter per kolf niet wordt overschreden om te voorkomen dat de agri stolt voordat de testplaten worden toegediend. Laat het medium na het autoclaveren afkoelen tot het aanraakbaar is om condensatie te minimaliseren. Het minimaliseren van vocht is cruciaal in deze experimenten, aangezien het vochtgehalte of mc.

Meer dan 80% zal anoxie in weefsels veroorzaken. Beperk afbraak door aerobe schimmels en verhoog eenmalig de variabiliteit. Koel. Gebruik een draagbare pipethulp en steriele polystyreen pipetten van 10 milliliter om aseptisch te werken.

Breng de agar over naar een hoge stapel platen in een veiligheidskast. Snijd vervolgens ruim plastic gaasroosters op maat om in de bodems van de platen te passen. Nadat de roosters zijn gesneden en grondig zijn gewassen met zeep en water, worden de gaasroosters klaargemaakt voor het drogen en autoclaveren voor deze demonstratie.

Zuidelijke geel dennenhout of SYP wordt gebruikt omdat het een belangrijke bron van hout is. Gebruik voor residentiële woningbouw in de VS onbehandeld hout en snijd knoophoutvrije blokken van 19 bij 19 millimeter uit een enkele longitudinale snede langs de nerf. Snijd deze lengte in blokken van 19 millimeter kubus.

Splits de blokken van 19 millimeter kubus doormidden in de richting van de nerf met een beitel en hamer in plaats van een zaag. Hierdoor ontstaat één ruwe blokrand die naar beneden op het plastic gaas in het agri-blok microkosmos wordt geplaatst en een gladde bovenrand voor de etikettering. Label de gladde zijde van de blokken met een potlood en snijd voldoende blokken voor de behandelingen, evenals de niet-geïnoculeerde controles die zowel dienen als contaminatiemonitoren als basisdatasamples die parallel worden geconditioneerd voor oven-gedroogd materiaal; plaats de samples in aluminium weipanen en in een convectieoven bij 100 degrees Celsius gedurende 48 uur.

Breng de monsters van de oven over naar een desiccator om ze af te koelen. Weeg de monsters vooraf om het initiële ovengedroogde gewicht te bepalen. Bereid tenslotte de monsters, inclusief de plastic rasters en het hout, voor op autoclaveren door ze strak in folie te wikkelen om bevochtiging te minimaliseren.

Het is niet vereist dat elk monster individueel wordt ingepakt, maar dat de blootstelling aan stoom laag en consistent is. Autoclaveer de gelabelde monsters bij 121 graden Celsius en 16 PSI gedurende één uur. Stel in een steriele biosafety cabinet lege AE's, een bronplaat voor het inoculums gaas plantensubstraat exogene materialen, een marker, paraformstrips, pincetten en overdrachtsinstrumenten samen.

De volgende stap van de inoculatie is het toevoegen van de items aan de agri-petrischalen om het risico op contaminatie te minimaliseren. Vlamysteriliseer de transferinstrumenten en de pincet met 95% ethanol naarmate deze worden gebruikt. Voeg eerst het plastic gaas toe aan de petrischaal.

Voeg vervolgens hier het houtsubstraat toe. Er worden twee houten blokken langs de lengte van het gaas geplaatst, zodat gegevens van de vroege en late oogsten kunnen worden gekoppeld. Deze blokken worden zij aan zij geplaatst, met de nerf gericht naar de bron van het schimmelinoculum.

Voeg vervolgens de exogene materialen toe. Hier wordt de rol van gips getest op het verval door een filamenteuze schimmel. Daarom moet de schimmel deze gipsschijven tegenkomen voordat hij het hout bereikt.

Tussen elk blok en elk inoculatiepunt op het gaas wordt één gipsdisc geplaatst. Let erop dat de discs in het hout elkaar niet raken, maar houd ze wel dicht bij elkaar. Gebruik voor het schimmelinoculum een kurkenboor nummer vier met een diameter van 7 mm om pluggen te maken van twee weken oude culturen die zijn gegroeid in 20 ml agar.

Dit helpt om het inokulumvolume te beheersen. Voor niet-geïnoculeerde controles is het raadzaam om een plug van een steriele plaat toe te voegen. Voorkom contact tussen het inokulum en zowel de exogene substraten als het hout, maar plaats ze dicht bij elkaar.

Gebruik één inoculatieplug per blok. Seal de schalen met parafilm die met een scheermes is afgesneden; houd de platen horizontaal en wikkel de parafilm in een vloeiende, continue beweging. Label tot slot de schaaldeksels met een alcoholbestendige marker, waarbij de bloknummers direct boven de respectieve substraten worden genoteerd.

Teken ook cirkels over de gipsschijven. Plaats de platen voorzichtig in een biologische incubator om schudden van de inhoud te voorkomen en condensvorming door temperatuurschommelingen te minimaliseren. De gebruikte condities zijn 20 °C en in het donker; voer de tijdserie-oogsten aseptisch uit, behalve voor de laatste oogst.

Verwijder bij het oogstpunt van week vijf de gehele behandelingsgroep. Bespuit elke boven- en onderzijde met 70% ethanol en gebruik gevlamde pincetten om het materiaal in de biosafety cabinet te verwijderen. Maak foto's voordat de agri-platen worden vernietigd, met de nadruk op morph F of meloen.

Verwijder vervolgens de blokken die behandeld moeten worden. Rol overtollig pha weg, maar wees voorzichtig om geen vergaand materiaal te verliezen. Droog de blokken in aluminium bakken en bepaal het massaverlies aan de hand van het versgewicht en drooggewicht van de controles om overmatige capillaire werking te monitoren.

Gegevens over massaverlies helpen bij het bepalen van de voortgang van het verval en zijn belangrijke gegevens. Indien elementconcentraties op basis van het gramgewicht moeten worden berekend, moeten de percentagegegevens worden genormaliseerd. Markeer en volg voor de statistieken alle donkerbruine blokken, die duidelijk verzadigd zijn met water.

Vernietig tot slot de culturen in autoclaafzakken, waarbij het plastic steunrooster en alle andere componenten die gerecycled kunnen worden voor gebruik in toekomstige experimenten worden bewaard. Bij de agri-block microkosmos-opstelling rusten de dennenhouten blokken op een plastic rooster om de blokken boven het agri-contact te verheffen. Circulaire Crains groeiden in direct contact met de gipsoppervlakken en in de houten blokken.

Dit mycelium vormt een belangrijke verbinding tussen hout en exogene bronnen van voedingsstoffen. Het beheersen van deze exogene materiaalbronnen in agar of vaste materialen is een belangrijk voordeel van een agri-blokontwerp ten opzichte van een bodemblokontwerp. Hier wordt het gemiddelde gewichtsverlies in procenten getoond als maatstaf voor de mate van houtafbraak door ser crain's na vijf en 15 weken incubatie met dennenhout in agri-blok microkosmen.

Er werden geen behandelingen toegepast. Vijf millimolar calciumchloride werd toegevoegd aan agar met meer dan 99% puur gips of gips aangevuld met 1% ijzer voor elke oogst; balken met dezelfde letter verschillen niet significant. Met foutbalken die de standaarddeviatie vertegenwoordigen, werd een gewichtsverlies van meer dan 60% waargenomen in de controleblokken van bruinrot-dennenhout, wat voldoet aan het standaarddoel van de American Society for Testing and Materials van meer dan 50% verval.

De gemiddelde variatiecoëfficiënt in verval was 0,055 in week 16. Naast de lage variabiliteit werd eenbehandelingseffect waargenomen. Schimmelverval werd geremd door toevoegingen van calcium, zowel aan de agar als calciumchloride of als puur gips.

Interessant is dat de afbraaksnelheden herstellen bij de toevoeging van ijzer aan het gips. Dit suggereert dat ijzer, en niet calcium, cruciaal is bij de observatie van de vijf herhalingen in week 15 van de afbraak. Bij dezelfde bruinrot-testschimmel, circulaire lamellen, onthult de kleur van de mycelia mein.

Verschillen in externe hyfen tussen de behandelingen; blokken werden verwijderd en gedroogd. Hieruit bleek een gebrek aan mycelium in de calciumvrije behandeling. De vergeling in de zuivere calciumbehandelingen en het roestachtige uiterlijk in de met ijzer aangevulde behandeling werden waargenomen.

De controle vertegenwoordigt niet-geïnoculeerde blokken voor vergelijking. Interessant genoeg gaan de hoofdeffecten verloren bij gebruik van een medium met een hoog ijzergehalte. Gezamenlijk suggereert dit dat deze schimmel ijzer benut, en geen calcium.

In deze materialen hebben we aangetoond hoe u een auger-blokopstelling kunt gebruiken om de biologische afbraak van plantenweefsels door aerobe filamenteuze schimmels succesvol te testen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de substraten geen contact met elkaar mogen maken, in het bijzonder het plantenweefsel en de auger; minimaliseer het vochtgehalte van de auger en de plaatjes, en controleer dubbel of de inhoud van elk plaatje niet is verschoven vóór de incubatie. Door rekening te houden met deze variabelen kunt u de afbraakomgeving veel beter beheersen dan bij het gebruik van een bodemblokopstelling.

U kunt gegevens genereren met de statistische kracht die nodig is om uw onderzoeksvragen te beantwoorden. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.