Eiwitkristallisatie voor X-ray kristallografie

Het algemene doel van deze procedure is om proteïnekristallen te produceren voor röntgendiffractie-experimenten. Er worden drie verschillende technieken voor kristalscreening gedemonstreerd; dampdiffusie-kristallisatiemethoden, waaronder de hanging drop- en sitting drop-methode, alsmede micro-batch kristallisatiemethoden voor dampdiffusie-kristallisatie, worden beschreven. De wells worden gevuld met precipitant.

Vervolgens wordt een hoge concentratie van het gezuiverde eiwitmonster gemengd met het precipitatieagens. De gemengde druppel wordt daarna verzegeld in een putje dat de precipitantoplossing bevat. Microbatch-kristallisatie begint met het vullen van het putje met paraffineolie.

Het eiwit wordt vervolgens in de putjes geladen, gevolgd door de precipitantoplossing. De laatste stap van alle methoden is om het systeem te laten equilibreren en het verschijnen en de groei van kristallen in de druppels te volgen. Uiteindelijk kunnen er met deze techniek kristallen worden verkregen, waarna het diffractiepatroon van het eiwit kan worden bepaald met behulp van een röntgenbron met een geschikte detector.

Hallo, ik ben Sal uit het laboratorium van professor Yoga Motis van de afdeling moleculaire biofysica en biochemie aan de Yale University. Vandaag laten we u een procedure zien voor de kristallisatie van een gezuiverd eiwit. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de structurele basis van virale infecties te bestuderen.

Laten we beginnen met het kweken van enkele kristallen. Om een crystallisatiemethode voor een gekozen macromolecuul te identificeren, kunnen initiële screenings worden uitgevoerd met commercieel verkrijgbare crystallisatie-oplossingen, die zijn samengesteld om gebruik te maken van de sparse matrix incomplete factorial-methode van testcondities. Deze condities zijn geselecteerd op basis van bekende en veelvuldig succesvolle crystallisatiecondities voor macromoleculen.

Zodra de kristallisatieconditie bekend is, kan een nauwe screening worden opgezet waarbij de concentratie van het precipitant wordt gevarieerd bij een pH rondom de oorspronkelijke hit. Meestal bestaan de kristallisatiecondities die voor deze screenings worden gebruikt uit een precipiterend middel en een buffer om de pH in te stellen; alle stamoplossingen moeten voor deze demonstratie worden gefilterd door een 0,22 micron filter. De eerder geïdentificeerde kristallisatiecondities voor kippenlysosoom worden gebruikt met natriumchloride als precipitant; begin de procedure door één milliliter oplossingen te bereiden van verschillende concentraties natriumchloride in 0,1 molair natriumacetaat bij diverse pH-waarden.

Ontdooi vervolgens het eiwitmonster dat is bewaard bij -80 °C en houd dit op ijs. Typische eiwitconcentraties liggen in het bereik van 5 tot 50 mg/mL, waarbij hogere concentraties doorgaans betere resultaten geven. In dit geval wordt een oplossing van 50 mg/mL kippenlysosoom in 0,02 M natriumacetaat bij pH 4,9 gebruikt.

Centrifuge het monster 15 minuten bij 18.000 G en vier graden Celsius om eventuele gedeeltelijk geaggregeerde eiwitten of neerslag uit de ontdooistap te verwijderen. Deze aggregaten kunnen de kristalgroei hinderen en verdere aggregatie bevorderen. Na centrifugatie.

Bepaal de proteïneconcentratie op basis van de absorptie bij 280 nanometer met behulp van een UV-spectra fotometer. De proteïneconcentratie kan worden berekend aan de hand van de absorptiewaarde en de extinctiecoëfficiënt van het proteïne. Zodra het proteïnemonster gereed is, vul een kristallisatieschaal voor hangende druppels met 24 putjes met 500 microliters precipitantoplossing volgens de plattegrond van de schaal.

Breng een ring van siliconenvet aan langs de rand van elke well, waarbij de ring niet volledig wordt gesloten zodat lucht uit de well kan ontsnappen. Reinig het dekglas met perslucht of een professioneel pluisvrij doekje om stof te voorkomen; dit vergemakkelijkt de interpretatie van de kristallisatiedruppels en elimineert contaminaties. De volgende stap is het pipetteren van gelijke volumes van het eiwitmonster en de reservoirvloeistof op het dekglas.

Er kunnen echter verschillende volumes eiwit en precipitant worden uitgeprobeerd als onderdeel van het optimalisatieproces; het gebruik van meer eiwit dan precipitant resulteert in een netto concentratie van het eiwit in de geëquilibreerde druppel, wat wenselijk kan zijn voor verdunde eiwitmonsters of om de nucleatie of groei van kristallen te vertragen. Voor deze demonstratie worden 2 µL lysozym van 50 mg/mL in 0,02 M natriumacetaat bij pH 4 in het midden van het dekglas aangebracht, gevolgd door 2 µL kristallisatielosung.

Wees uiterst voorzichtig bij het pipetteren van het eiwit en de reservoir-oplossing op het dekglas om beluchtingsvorming te voorkomen, wat vaak gebeurt wanneer er lucht uit de pipet wordt geblazen. Meng de druppel voorzichtig met een pincet om voortijdige eiwitprecipitatie te voorkomen als gevolg van lokaal hoge concentraties precipitant in de druppel; mengen is bijzonder belangrijk bij viskeuze precipitanten zoals polyethyleenglycol. Kantel het dekglas voorzichtig en plaats het op de vetring bovenop de well; doe dit in een richting waarbij de lucht uit de well kan ontsnappen.

Anders kan de lucht het dekglas optillen, waardoor de afdichting van het welletje in gevaar komt. Ga door naar het volgende welletje totdat de plaat volledig is gevuld. Zodra de plaat is klaargezet, dient deze visueel te worden geïnspecteerd om stofdeeltjes en andere verontreinigingen te verwijderen, wat de foutpositieve identificatie van proteïnekristallen kan verminderen.

Gebruik een scoreblad om het experiment te documenteren. Plaats vervolgens de plaat bij de gewenste incubatietemperatuur, over het algemeen tussen 4 °C en kamertemperatuur. De meest succesvolle temperatuur is 20 °C.

Hanteer de plaat voorzichtig; vermijd schudtrillingen of temperatuurveranderingen tijdens het overbrengen of de incubatie, aangezien deze kristalgroei kunnen voorkomen of de kristalkwaliteit negatief kunnen beïnvloeden. Controleer de plaat de volgende dag op kristallen en vervolgens om de paar dagen, waarbij de platen altijd zorgvuldig worden gehanteerd. Documenteer alle bevindingen en druppelmorfologieën op een specifiek scoreblad voor de plaat.

Kristallen verschijnen gewoonlijk na twee tot vijf dagen, hoewel kristallen soms vrijwel onmiddellijk of pas na enkele maanden verschijnen. Zodra de crystallisatiecondities zijn vastgesteld en de groeisnelheid van de kristallen bekend is, is het raadzaam om de trays ongestoord te laten totdat er kristallen zijn verschenen en deze tot ten minste de helft van hun uiteindelijke grootte zijn gegroeid. Door de trays ongestoord te laten, kan het aantal nucleatiegebeurtenissen worden verminderd, wat resulteert in een kleiner aantal grotere kristallen. Volg voor sitting drop crystallisatie dezelfde procedure als voor hanging drop, behalve dat we een 24-well sitting drop tray gebruiken waarbij dekglasplaatjes niet nodig zijn.

In plaats daarvan bevat de put een plateau waarop het eiwit en het precipitatiemiddel worden gemengd; pipetteer twee µL van een 50 mg/mL lysozymoplossing op het midden van het plateau, waarbij de vorming van luchtbellen wordt voorkomen. Voeg vervolgens twee µL precipitatiemiddeloplossing toe aan het monster na de installatie van het plateau. Seal de putten met optische tape bij de zittende druppelmethode.

Dekglasjes zijn niet nodig. Ga verder met de incubatie en de kristalscore zoals beschreven voor de hanging-drop methode. Om een micro-batch procedure uit te voeren.

Bereid de crystallisatie-oplossing en het eiwit voor zoals beschreven voor de hanging drop-methode. Gebruik een nieuwe microbatch-tray en spuit deze schoon met perslucht om stof en andere grote deeltjes in de microbatch-tray te voorkomen. Voeg aan elke well paraffineolie toe tot een diepte van drie millimeter.

Verwijder vervolgens het overtollige olie. Pipetteer daarna één µL van de eiwitoplossing in het vooraf gevulde putje, waarbij u ervoor zorgt dat de druppel naar de bodem van het putje zakt. Pipetteer vervolgens één µL van de precipitantoplossing in het putje.

Zorg ervoor dat de druppel naar de bodem van het well zinkt en versmelt met de proteïnedruppel. Ga door naar het volgende well tot de plaat is voltooid en ga verder met de incubatie en kristalanalyse zoals hier beschreven. Typische resultaten van proteïnekristallisatie.

De experimenten worden getoond. Amorfe precipitatie treedt op wanneer het eiwit en/of het precipitant in hoge concentratie aanwezig zijn. Omgekeerd blijven druppels die onverzadigd zijn meestal helder.

Fasescheiding kan optreden als het eiwit of detergent scheidt naar een andere fase wanneer het bij een hoge concentratie wordt gemengd met bepaalde neerslagmiddelen. Onder optimale omstandigheden zouden Arabidopsis csn-eiwitkristallen moeten vormen. Zeven eiwitkristallen die zijn verkregen in polyethyleenglycol 8.000 en magnesiumacetaat hebben een staafvormig uiterlijk.

Ook getoond worden kristallen van lysosoomproteïnen die zijn verkregen in één molaire natriumchloride en natriumacetaat bij pH 4,9. Deze time-lapsefilm demonstreert dat lysosoomkristallen binnen enkele uren na de opzet uitgroeien tot grote prisma's wanneer de hanging drop-methode wordt gebruikt.

We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u een eiwitexperiment opzet bij het uitvoeren van deze procedure. Het is belangrijk om te werken in een omgeving met een stabiele controle van temperatuur en vochtigheid, aangezien een hoge luchtvochtigheid helpt om verdamping van de druppel te minimaliseren; probeer een techniek toe te passen die de blootstelling van de druppel aan de open lucht minimaliseert. Om deze reden is het essentieel om te werken in een goed georganiseerde werkomgeving.

Dat was het. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.