Geoptimaliseerd transfectie strategie voor Expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ion kanalen in HEK-293T cellen

Elektrofysiologie wordt veelvuldig gebruikt om de activiteit van recombinante spanningsafhankelijke ionkanalen in gecultiveerde menselijke embryonale niercellen te bestuderen. Voor een succesvolle registratie is het vereist dat de cellen kanalen in voldoende mate in het celmembraan tot expressie brengen voor detectie, en dat de cellen met een lage genoeg celdichtheid worden gezaaid om individuele cellen te kunnen isoleren. Het uitvoeren van celregistraties wordt vaak bemoeilijkt door de lange incubatieperioden bij 28 °C die nodig zijn voor deze expressie, waarbij doorgaans een verlies van celadhesie en membraanstabiliteit optreedt.

Hier wordt een geoptimaliseerde methode voor celkweek en transfectie gedemonstreerd die deze problemen omzeilt. De cellen worden getransfecteerd bij een matige confluentie en vervolgens geïncubeerd bij 28 °C totdat een adequate expressie van de ionkanalen is bereikt. De getransfecteerde cellen worden vervolgens bij een lage dichtheid op glazen dekglasjes geplaatst en gedurende enkele uren geïncubeerd bij 37 °C om celadhesie en membraanstabilisatie mogelijk te maken.

Zodra ze op de juiste wijze zijn uitgeplaat, worden de cellen geïdentificeerd op basis van co-expressie van EGFP en whole-cell patchclamp. De opname kan worden uitgevoerd of de cellen kunnen opnieuw worden geïncubeerd bij 28 °C. Om de expressie van kanalen op het celoppervlak verder te verhogen, tonen resultaten van opname-experimenten op cellen die zijn getransfecteerd met spanningsafhankelijke calciumkanalen, zoals L CAV 1, L CAV 2 of L cav 3, aan dat de kanalen succesvol zijn getransfecteerd en tot expressie zijn gebracht door de cellen.

Hoewel er slechts representatieve resultaten voor L CAV drie worden getoond, hebben we in ons laboratorium een methode ontwikkeld om de expressie van ionkanaalgenen met een lage expressie te verbeteren voor patch-clampmetingen in menselijke cellijnen. De conventionele aanpak is momenteel om de cellen eerst op dekglasplaatjes uit te plaattsen en te transfecteren met plasma CDNAs die de ionkanaalgen bevatten, om vervolgens meerdere dagen bij 28 °C te incuberen om een hoogefficiënte ionkanaalexpressie te bereiken voorafgaand aan de elektrofysiologische meting. Onze nieuwe aanpak vermindert de benodigde incubatietijd bij 28 °C vóór de meting aanzienlijk.

Door de incubatietijd van 28 °C te verkorten, stellen we vast dat celmembranen veel stabieler zijn en de getransfecteerde cellen veel beter hechten aan de dekglasjes. Dit verhoogt het aantal registreerbare cellen en maakt de experimenten aanzienlijk efficiënter. Splits vóór de transfectie een volledig confluente kolf met HEK 2 9 3 T-cellen in een verhouding van één op vier over naar een nieuwe kolf van 25 cm², en plaats de cellen in een incubator op 37 °C met 5% CO2.

Laat de cellen drie tot vier uur hechten; onderzoek de cellen na vier uur met differentieel interferentiecontrast om de hechting te verifiëren. Let op dat de cellen niet langer rond zijn en zich afplatten. Extensies of pseudopodia zijn zichtbaar.

Cellen met een lagere confluentie zien er hetzelfde uit, maar liggen verder uit elkaar. Zodra de cellen zijn gehecht, combineert u de benodigde reagentia om een standaard calciumfosfaat-transfectie uit te voeren. Bereid in totaal 12 micrograms DNA voor in 600 microliters transfectieoplossing per kolf.

Hier worden cDNA's van diverse ionkanalen gekloond in het P-I-R-E-S twee EGFP-plasmide. Transfectie van deze expressievector in een zoogdiercellijn resulteert in de productie van enhanced green fluorescent protein uit hetzelfde mRNA als het gekloonde insert, via translatie die wordt geïnitieerd bij een interne ribosoom-entrysite stroomafwaarts van de coderende sequentie van het ionkanaal en stroomopwaarts van de coderende sequentie van het EGFP. Hierdoor kunnen positief getransfecteerde cellen worden geïdentificeerd zonder mogelijke interferentie in de eiwitfunctie die veroorzaakt zou kunnen worden door het EGFP-eiwit direct te fuseren aan het eiwit van interesse.

Pipetteer de transfectie-oplossing druppelsgewijs over de cellen, draai vervolgens voorzichtig met de fles en plaats deze gedurende de nacht in de incubator van 37 °C. Controleer de transfectie-efficiëntie door de cellen onder een fluorescentiemicroscoop te bekijken. Positief getransfecteerde cellen moeten over de gehele cel groen kleuren.

Zodra de transfectie is geverifieerd, pipetteer voorzichtig vier tot vijf milliliter warm medium in de omgekeerde kolf. Was de cellen door de kolf langzaam om te draaien zodat het celoppervlak naar beneden wijst en de kolf voorzichtig te schudden zodat de wasoplossing zachtjes over de cellen beweegt. Verwijder het medium en herhaal deze wasstap.

Stap nog twee keer. Voeg vervolgens zes milliliters medium toe aan de kolf en incubeer gedurende twee uur bij 37 °C. De expressie van ionkanalen van ongewervelden brengt enkele uitdagingen met zich mee.

Ten eerste zijn ze vaak groot en kan de translatie aan het endoplasmatisch reticulum daarom lang duren. Daarnaast worden ze mogelijk niet efficiënt naar het celmembraan getransporteerd in een zoogdiercellijn. Ten slotte kunnen heterologe CDNAs, aangezien verschillende soorten variërende frequenties in codongebruik vertonen, een hoge frequentie bevatten van codons die ongebruikelijk zijn in zoogdiercellen zoals HEK 2 9 3 T, om sommige van deze moeilijkheden te overwinnen.

Na de incubatie van twee uur bij 37 °C na het wassen van het transfectieproduct, worden de flessen voor twee tot zes dagen overgebracht naar een incubator van 28 °C om de expressieperiode te verlengen. De incubatietijd moet empirisch worden bepaald voor elk type ionkanaal dat tot expressie wordt gebracht, aangezien incubatie bij 28 °C gedurende langere perioden leidt tot celdetachement en een slechte membraanstabiliteit.

Verdere celvoorbereiding is nodig voorafgaand aan het uitvoeren van elektrofysiologische studies. Verwijder eerst het medium van de getransfecteerde cellen met een aspiratiepipet en voeg één milliliter trypsine-oplossing van 37 °C toe aan een omgekeerde kolf. Zet de kolf vervolgens voorzichtig terug in de positie waarbij het oppervlak van de cellen naar beneden is gericht, zodat de trypsine zachtjes over de cellen kan stromen.

Zet de kolf terug en verwijder de trypsine. Voeg vervolgens 250 µL warme trypsine direct op de cellen toe en incubeer gedurende drie tot vijf minuten bij 37 °C totdat de cellen loslaten. Plaats ondertussen drie tot acht met poly-L-lysine gecoate dekglasjes in een kweekschaal van 60 mm en voeg 5 mL warm kweekmedium toe.

Zodra de cellen zijn losgekoppeld, worden ze door ongeveer zes keer op en neer pipetteren gesuspendeerd in vier milliliter warm medium. Druk vervolgens met de punt van de micropipet op de dekglasjes om er zeker van te zijn dat ze zich onderin de schaal bevinden. Voeg daarna 250 tot 500 µL van de geresuspendeerde cellen toe. Incubeer de cellen gedurende drie uur bij 37 °C om ze te laten hechten aan de dekglasjes.

Het te lang laten staan van de cellen bij 37 °C zal leiden tot celdeling en verdunning van de getransfecteerde plasmiden. De getransfecteerde cellen moeten worden uitgeplaats met een voldoende lage dichtheid, zodat ze van elkaar geïsoleerd zijn zoals hier getoond. Dit zal de elektrofysiologische registratie vergemakkelijken.

Voor cellen die hulp-subunits vereisen, is het vaak noodzakelijk om de cellen over te brengen naar 28 °C en deze nog drie tot vier dagen te incuberen voordat de elektrofysiologische registratie plaatsvindt. Voor cellen die geen hulp-subunits vereisen, kan de registratie direct na deze incubatie worden uitgevoerd.

De hier gebruikte elektrofysiologische opstelling omvat een versterker, gemotoriseerde dubbele pipetmanipulatoren, een epifluorescentiemicroscoop en perfusiesystemen. De apparatuur is gemonteerd op een trillingsisolatetafel. Elektrische ruis wordt beperkt door een 40 inch hoge type twee Faraday-kooi. De elektronische controlesystemen omvatten een pc uitgerust met een Digitidata 1440, een analoog-digitaal converterinterface in samenhang met pClamp 10.1-software.

De monitorversterker van de computer, de gemotoriseerde manipulator en een profusiecontrolesysteem met klepkoppelingen zijn allemaal buiten de kooi van Faraday gemonteerd. Op een vrijstaand metalen elektrisch rek van 19 inch is alle elektrische apparatuur geaard via een koperen verdeelstrip en aangesloten op een isolatietransformator van medische kwaliteit, die zorgt voor lijnisolatie, een consistente aarding en piekspanningsonderdrukking. Bereid de experimenten voor door vuurgepolijste micropipetten met een weerstand van twee tot vijf mega ohm te monteren op de micropipetthouder op de headstage.

De patchpipetten worden gevuld met de interne oplossing; tik tegen de pipetten om luchtbellen te verwijderen en monteer ze vervolgens op de headstage. Gebruik daarna een pincet om één dekglas met geplaatste cellen over te brengen naar een plastic Petrischaal van 35 millimeter die drie milliliter externe registreeroplossing op kamertemperatuur bevat. Het volume van de registreeroplossing moet nauwkeurig worden gemeten bij het uitvoeren van drugexperimenten waarbij bekende hoeveelheden van een drug met een micropipet aan de schaal worden toegevoegd; plaats de schaal vervolgens op de microscooptafel.

Vul vervolgens een halfcel van een micro-elektrodehouder met drie molair cesiumchloride. Plaats daarna de referentie-elektrode in de halfcel en positioneer de maselektrode in het bad met behulp van de micromanipulator; breng de patchpipet naar beneden in de badoplossing. Visualiseer de cellen in fluorescentiemodus en centreer een geïsoleerde, positief getransfecteerde, adherente groene cel in het midden van het gezichtsveld.

Breng de patchpipet in badmodus dicht bij de cel. Zet de vierkantsgolf-curve die op het computerscherm wordt weergegeven op nul. Pas de positie van de patchpipet aan zodat deze de cel net raakt en de vierkantsgolf-stroomcurve op het scherm begint te fluctueren.

Pas een zachte zuiging toe met een aangesloten spuit tot er een giga-ohm seal is gevormd. Zodra een giga-ohm seal is bereikt, schakelt u het programma over naar de patch-modus. Pas een korte zuigpuls toe met de spuit om door het celmembraan te breken.

Schakel vervolgens over naar de celmodus en gebruik de celparameters op de versterker. Om de capacitieve transient te compenseren, is het noodzakelijk om de patch te equilibreren, zodat de intracellulaire registratie-oplossing kan dialyseren in de gepatchte cel. Voer hier de voltage-clamp-protocollen in die voor dit experiment zijn geschreven.

De experimentator heeft een protocol ontworpen om ionenstromen door spanningsafhankelijke ionkanalen te meten die ontstaan wanneer de spanning over het celmembraan wordt gemoduleerd. In dit geval kijken we naar een IV-protocol waarbij de software de cel op minus 110 millivolt houdt en vervolgens een stap zet naar minus 70 millivolt voor 250 milliseconden. Daarna volgt een terugkeer naar het rustpotentiaal van minus 110 millivolt, waarbij elke volgende stap met 10 millivolt toeneemt, zodat de stappen naar minus 70 millivolt, minus 60 millivolt, enzovoort gaan, totdat de laatste stap naar plus 20 millivolt is.

Filter de geregistreerde stromingen bij 10 kilohertz met een Lowpass Bessel-filter op de versterker en digitaliseer bij een bemonsteringsfrequentie van twee kilohertz met de clamp X 10.1-software; gebruik alleen registraties met een minimale lekkage van minder dan 10%. Voor de analyse werden HEK 2 93 T-cellen gekweekt en getransfecteerd met L Cav. Drie calciumkanalen, zoals hier getoond. Succesvolle transfectie van heterologe ionkanaal-cDNA's werd aangetoond door fluorescentie gegenereerd vanuit de P-I-R-E-S twee eeg FP-vector.

Hier tonen we de succesvolle expressie van een cav3-spanningsafhankelijk calciumkanaal uit een ongewervelde. Wanneer cellen niet zijn getransfecteerd, kunnen er geen calciumstromen worden opgewekt. Getransfecteerde cellen genereren daarentegen grote stromen wanneer whole-cell voltage-clamp-protocollen op de cellen worden toegepast.

Experimentatoren kunnen verschillende elektrofysiologische condities en data-analyseregimes gebruiken, afhankelijk van hun vereisten. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om uw eigen oordeel te gebruiken met betrekking tot de timing van de experimenten. Aangezien verschillende kanalen met verschillende efficiënties in het celmembraan worden tot expressie gebracht, is het aan u om de optimale strategie te bepalen om zowel de levensvatbaarheid van de cellen te verhogen als de oppervlakte-expressie van de kanalen waarin u geïnteresseerd bent te maximaliseren.

Na het bekijken van deze video hopen we dat u een goed inzicht heeft gekregen in het cultiveren en onderhouden van een menselijke cellijn, evenals in het transfecteren van heterologe ionkanaal-cDNA's en subunit-cDNA's in deze cellen voor elektrofysiologische registraties.