Isolatie van hersenen en ruggenmerg mononucleaire cellen met behulp van Percoll Verlopen

Immuuncellen infiltreren het centrale zenuwstelsel tijdens infecties, trauma, autoimmuniteit of neurodegeneratie. Hoewel histochemische benaderingen kunnen worden gebruikt om de locatie van de infiltrerende cellen te bepalen en de geassocieerde pathologie te analyseren, worden deze technieken beperkt door het aantal antilichamen dat gelijktijdig kan worden gebruikt. Hier wordt een methode getoond voor de snelle isolatie van mononucleaire cellen uit hersen- en ruggenmergweefsels, waarbij het geprepareerde weefsel eerst wordt gehomogeniseerd.

Vervolgens wordt er een Percoll-gradiënt opgezet en worden, na centrifugatie, de mononucleaire cellen van de interface verzameld. Ten slotte worden de cellen gespoeld en gekleurd met antilichamen. Via flowcytometrie-analyse worden hematogene cellen en surveillancemicroglia onderscheiden, waarna hun relatieve proporties tijdens ziektestadia kunnen worden bepaald. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals een Aris-gradiënt of histochemie, is dat deze minder tijdrovend is.

Hiermee kunt u meer weefsels tegelijkertijd verwerken. De gradiëntopstelling wordt gedemonstreerd door een technicus uit mijn laboratorium. Bereid de reagentia voor die nodig zijn voor dit protocol. Begin met vier milliliters isotonic perol stockoplossing, aangeduid als SIP, per brein.

Om dit te doen, combineert u negen delen perol met één deel 10x HBSS zonder calcium en magnesium door mengen via inversie. Bereid vervolgens 70% per call door de bereide SIP te mengen met 1x HBSS zonder calcium en magnesium. Dispenseer daarna twee milliliter van de 70% per cole in een polypropyleen conische buis van 15 milliliter om weefsel te verzamelen.

Plaats voor deze procedure de gedissekeerde hersenen en ruggenmergen van alle studiemuizen in bekerglazen met 10 milliliters RPMI op ijs. Draag het weefsel vervolgens over naar een homogenisator van zeven of 15 milliliter die drie milliliters eenmalig HBSS bevat. Maak met een lospassende stamper van maat B voorzichtig een celstuspensie en stap daarna over op een strakpassende stamper van maat B om de weefsels verder te dissociëren.

Zodra het weefsel is gehomogeniseerd, voegt u RPMI of één keer HBSS toe tot een eindvolume van zeven milliliter en gaat u over tot het opzetten van de gradiënt om de PERCOCO-gradiënt te maken. Begin met het toevoegen van drie milliliter SIP aan de cel-suspensie tot een uiteindelijke PERCOCO-concentratie van 30%. Houd er rekening mee dat de Percoll op kamertemperatuur gebruikt moet worden. Als dit koud wordt gebruikt, hebben de cellen de neiging om te klonteren en is de celseparatie minder efficiënt.

Breng vervolgens, met behulp van de pipetteerhulp in de zwaartekrachtmodus, de 10 milliliter celсусpensie langzaam in lagen aan bovenop de 70% SIP. Vermijd menging van de 70% en 30% oplossingen. Dit is de meest kritische stap van de procedure.

Er moet een zeer duidelijke vlakke lijn zichtbaar zijn bij de overgang van 70 naar 30%. Over het algemeen zullen personen die nog niet bekend zijn met deze methode moeite hebben, omdat de derde oplossing en de 70%-oplossing tijdens het laagjes maken zullen mengen. Volgende stap, om de interface te stabiliseren: centrifugeer 30 minuten bij 500 Gs op 18 graden Celsius.

Zorg ervoor dat de centrifuge stopt met een minimale of geen remming, zodat de interface niet wordt verstoord. Na het centrifugeren van de gradiënten moet er een dikke en viskeuze laag debris aan de bovenkant van de buis ontstaan. De volgende laag is de geelachtige 30% percore-laag, die soms debris bevat.

Vervolgens volgt de interface tussen de 70% en 30% lagen, die een duidelijk witte halo moet vertonen en de mononucleaire cellen bevat. Ten slotte bevindt zich onderaan de buis de heldere 70% Percoll-laag. Als er geen interface zichtbaar is, zal de celopbrengst waarschijnlijk zeer laag zijn, waardoor verdere analyse extreem moeilijk wordt.

Daarom kunnen op dat moment verse celsuspensies nodig zijn om contaminatie te verminderen. Verwijder voorzichtig de laag debris van de bovenkant van de buis en gooi deze weg. Gebruik vervolgens een plastic pipet om door de bovenste 30%-laag te gaan, verzamel twee tot drie milliliters van de 70/30-interfase en breng dit over naar een schone conische buis met acht milliliters 1x HBSS.

Meng de verdunde interfaces een paar keer door inversie en centrifugeer vervolgens zeven minuten bij 500 GS bij 18 °C. Verwijder na het centrifugeren de supernatant en resuspendeer het pellet. Breng de celсусpensie over in een buisje van 1,5 ml met één milliliter celkleuringsbuffer en was deze nog één keer.

Centrifuge één minuut bij 10.000 ×g bij vier graden Celsius voordat u overgaat tot antilichaamkleuring. Resuspendeer de pellets in 50 µL gezuiverde anti-US CD 16, CD 32, verdund 1:200 in celkleuringsbuffer om de FC-bindingsplaatsen te blokkeren. Zoals bij elke kleuringsprocedure is het essentieel dat alle antilichamen adequaat worden getitreerd. Incubeer 10 minuten op ijs. Verwijder tijdens de incubatie twee tot vijf µL cellen en tel deze met een hemocytometer.

De gecombineerde weefsels van de naïeve hersenen en het ruggenmerg zouden ongeveer drie tot vijf keer 10^5 cellen per muis moeten opleveren. Ontstoken hersenen zullen variërende aantallen ontstekingscellen bevatten, afhankelijk van het tijdstip van afname en het ziektemodel. Voeg na de incubatie met CD 16 en CD 32 50 µL van een immuuncelspecifieke antilichaamcocktailmix toe. De mix die in dit voorbeeld wordt gebruikt, bevat antilichamen tegen CD 45, CD 4 en CD 19; incubeer dit gedurende 30 minuten op ijs.

Belangrijk is dat elk antilichaam eerst getitreerd moet worden. Om de optimale verdunning te bepalen, gebruikt u geschikte fluorochroomcombinaties die zijn gekozen op basis van de mogelijkheden van de laser- en filterinstellingen van uw specifieke flowcytometer. Was de cellen na het kleuren in celkleuringsbuffer door één milliliter celkleuringsbuffer toe te voegen en ze één minuut te centrifugeren.

Centrifuge bij 10.000 Gs na het centrifugeren, verwijder de bovenzit en resuspendeer de pellets in 100 tot 200 µL celkleuringsbuffer voor onmiddellijke flowcytometrische analyse of voor latere analyse. Resuspendeer de cellen in 2% paraformaldehyde bereid in PBS en bewaar deze overnight bij vier °C. Hier worden mononucleaire cellen getoond die zijn verkregen en geïncubeerd met FC-block, gevolgd door anti-CD45, CD4 en CD19 antilichamen.

In overeenstemming met het gedemonstreerde protocol scheidt CD 45-kleuring via flowcytometrie CD 45-hoge hematogene cellen effectief van CD 45-dim surveillancemicroglia. Deze figuur vergelijkt cellen geïsoleerd uit een naïef brein en een ontstoken brein van een muis bij wie experimentele auto-immuunencefalomyelitis is geïnduceerd. De CD 45 APC-intensiteit wordt op de Y-as weergegeven, waarbij drie duidelijk verschillende populaties zichtbaar zijn in het naïeve brein.

Er worden zeer weinig CD 45-high cellen gedetecteerd. Meestal minder dan 2% van de totale geïsoleerde populatie. In vergelijking hiermee vertonen hersenen van EAE-beïnvloede muizen een massale instroom van gerekruteerde bloedcellen in de hersenen.

De toevoeging van andere celoppervlaktemarkers zoals CD 11 b, CD 4, CD 8, enzovoort, maakt verdere karakterisering van de CD 45 high populatie mogelijk. Zodra de techniek beheerst is, kan deze in drie tot vier uur worden uitgevoerd indien deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat histologische benaderingen in combinatie met immuunfenotypering via flowcytometrie essentieel zijn om de samenstelling van de inflammatoire infiltraten in het CZS volledig te karakteriseren.