Cryopreservatie van Corticale Tissue Blocks voor de generatie van hoogverrijkt Neuronale culturen

Hallo, mijn naam is Alan en ik werk in het laboratorium van Dr. Horney Lu aan de University of California Irvine, bij de afdeling Neurobiology and Behavior. En ik ben Bob. Vandaag zal Dr. Haro u een snel, efficiënt en betrouwbaar protocol laten zien voor de routinematige cryopreservatie van corticale weefselblokken voor de daaropvolgende generatie van hoogwaardige primaire neuronale culturen.

Laten we beginnen. Gereinigd en fijngehakt weefsel wordt overgebracht in cryovials die een vriesmedium van 10% TMSO bevatten.

Cryovials worden in een vriescontainer geladen en gedurende ten minste vier uur bij -80 °C geplaatst. De bevroren cryovials worden vervolgens in vloeibare stikstof geplaatst voor langdurige opslag. Voor het kweken wordt de AC-cryovial gesmolten in een warm waterbad en gespoeld met warm HBSS om het resterende DMSO te verwijderen.

Vers HBSS wordt toegevoegd samen met trypsine voor dissociatie, waarna DMM met 10% EBS wordt toegevoegd. Om de dissociatieve enzymatische activiteit te stoppen, worden de cellen gecentrifugeerd en wordt het pellet geresuspendeerd in vers DMM plus 10% EBS en uitgeplaat op vooraf gecoate polylysine-schalen. Na 24 uur wordt DMM vervangen door een aangevuld neurobasaal medium en worden de cellen 10 dagen lang gekweekt.

In dit protocol wordt een stalen scheermes gebruikt voor het fijnmaken van corticaal weefsel vóór gebruik. Het mes moet gedurende ten minste twee uur worden gesteriliseerd in 70% ethanol. Een 1 x Hank's gebufferde zoutoplossing (HBSS) wordt bereid door een 10 x stockoplossing te verdunnen in gesteriliseerd water; de 1 x HBSS wordt vervolgens op ijs of bij vier graden Celsius bewaard tot de weefselverwerking.

Dimethylsulfoxide of DMSO wordt gebruikt als cryoprotectivum in het vriesmedium. Dit protocol maakt gebruik van een 10% volume/volume verdunning van DMSO in 1X-H-B-S-S-D-M-S-O, welke volledig gemengd moet worden voordat het bij vier graden Celsius wordt bewaard. Een Nalgene-vriescontainer wordt gebruikt om de vriesnelheid van de monsters te beheersen.

De vriescontainer wordt gevuld met vooraf gelabelde cryovials van 2,5 milliliter. Het is bovendien raadzaam om de vriescontainers zelf te labelen als u er meer dan één gebruikt, en de overeenkomstige container op de vial te vermelden. De vooraf gekoelde 10% DMSO, het vriesmedium en de vriescontainer worden in een steriele biologische veiligheidskabinet geplaatst.

Hier wordt één milliliter vriesmedium langzaam toegevoegd aan elk van de cryovials. Nadat is gecontroleerd of de doppen goed vastzitten, wordt de vriescontainer met de vials gedurende ten minste twee uur bij vier graden Celsius geplaatst, vlak voordat de weefselverwerking begint. Het eerder gesteriliseerde scheermes moet grondig worden gespoeld. Drie keer een wasbeurt van drie minuten.

Het gebruik van gesteriliseerd water zou voldoende moeten zijn om eventueel resterende ethanol te verwijderen. Deze wasprocedure moet snel worden uitgevoerd, aangezien het scheermesje gevoelig is voor oxidatie bij langdurige onderdompeling in steriel water. Voor het reinigen moet het weefsel op een icepack worden geplaatst.

Spoel lichtjes met koud X-H-B-S-S om eventuele vrijdrijvende resten te verwijderen. Gesteriliseerde naalden worden gebruikt om de weefselstukken te ontdoen van resterende membranen en bloedvaten. Er moet zorgvuldig worden gewerkt om de structurele integriteit van het weefsel tijdens het reinigen te behouden.

Naarmate dit toeneemt, zal de efficiëntie van het hakken van schoon weefsel zichtbaar verschillen van die van rauw weefsel; de meeste membranen of bloedvaten moeten zijn verwijderd. Zodra het weefsel is gereinigd en gespoeld, kan het hakken beginnen. Het is belangrijk om het weefsel in strakke sneden te verdelen, zodat er blokjes van ongeveer één millimeter kubiek ontstaan.

Blokken die te groot zijn, leiden tot een lagere celopbrengst bij het ontdooien. Bij kleinere blokken moet echter oververwerking worden vermeden. Gehakt weefsel kan worden opgevangen met een autopipet en een hoeveelheid gekoelde one X-H-B-S-S.

Zorg ervoor dat het schaaltje wordt gespoeld met HBSS om al het verzamelde weefsel te herstellen. Het weefsel wordt vervolgens toegevoegd aan een groot volume 1X HBSS en men laat het naar de bodem zakken, waardoor een los gepakte pellet ontstaat. Dit verwijdert eventuele resterende debris; terwijl het weefsel in de HBSS bezinkt, haalt men de eerder gekoelde vriescontainer en de cryovials tevoorschijn voordat het weefsel wordt verdeeld.

Zorg ervoor dat alle vials worden geopend om het proces van het vullen van het weefsel te versnellen. De blootstelling aan DMSO bij kamertemperatuur moet worden beperkt tot maximaal 10 minuten. Het is raadzaam om met één vriescontainer tegelijk te werken totdat al het weefsel is gebruikt.

Begin met het aspireren van het supernatant van een los weefselpellet, zo dicht mogelijk bij het pellet zonder dit te verstoren. Bevestig vervolgens een 200 µL tip met een brede opening aan een pipet. Gebruik geen tip met een kleinere opening, omdat dit de structuur van de blokken onderaan het weefselpellet zou kunnen beschadigen.

Verzamel langzaam 200 µL weefsel. Voeg dit weefsel toe aan een cryovial en herhaal dit voor de volgende vials totdat alle vials gevuld zijn. Mogelijk is een regel van 10 minuten van toepassing.

Plaats de vriescontainer met cryovials snel in een vriezer van -80 °C voor ten minste vier uur of overnacht als de tijd beperkt is. Verwijder na voldoende tijd de vriescontainer uit de vriezer en verdeel de cryovials zo snel mogelijk over een cryobox. Plaats de cryobox in een rek voor vloeibare stikstof voor langetermijnopslag.

Verwijder een cryovial zo snel mogelijk uit de vloeibare stikstof, waarbij de blootstelling van de cryoboxen aan kamertemperatuur wordt beperkt. Smelt het monster snel door het onder te dompelen in een waterbad van 37 °C. Houd de dop altijd boven het wateroppervlak. Controleer regelmatig en blijf ontdooien totdat er nog slechts een klein ijskristal zichtbaar is.

Steriliseer het cryovial met 70% ethanol voordat u het in de veiligheidskast plaatst. Voeg een groot volume warme 1X HBSS toe aan het ontdooide weefsel als er weefsel aan de wanden van het cryovial blijft kleven. Verzamel het weefsel voorzichtig met de HBSS.

Zodra al het weefsel is verzameld, wordt de buis drie tot vier keer omgekeerd en krijgt het weefsel de tijd om naar de bodem te zakken. Deze stap waarborgt een voldoende verdunning van DMSO.

Zodra het weefsel is bezonken, wordt zoveel mogelijk van het supernatant geaspireerd. Voeg vervolgens 10 milliliter warme, verse one X-H-B-S-S toe. Voeg 300 microliters 0,25%trypsine en 50 microliters DNAs toe.

Ga verder met het dissociëren van het weefsel door middel van zachte agitatie, waardoor een troebele cel-suspensie ontstaat nadat het weefsel is gedissocieerd. Stop de enzymatische activiteit door warm DMEM plus 10% verrijkt runderserum toe te voegen en centrifugeer de cel-suspensies bij 1200 G gedurende vijf minuten. Resuspendeer de celpellet in vers DMEM plus 10% EBS en zaai deze uit op met polylysine gecoate platen.

Laat de cellen 30 minuten hechten aan de schaaltjes. Vervang vervolgens het medium door vers DM plus 10% EBS. Vervang na 24 uur het medium met DM door neurobasaal medium aangevuld met N2 en B27 en kweek deze gedurende 10 dagen.

We hebben zojuist een uitgebreid, efficiënt en betrouwbaar protocol beschreven voor de routinematige cryopreservatie van corticale weefselblokken. Veel succes.