Mitochondriale Isolatie van skeletspieren

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van mitochondriën en het uitvoeren van mitochondriale respiratie. Dit wordt bereikt door eerst skeletspieren te isoleren van Sprague-Dawley ratten. Vervolgens wordt de spier gehomogeniseerd en worden de mitochondriën geïsoleerd door middel van centrifugatie.

De proteïneconcentratie wordt vervolgens bepaald met behulp van de Bradford-assay. Ten slotte wordt de mitochondriale respiratie gemeten via polygrafie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die het zuurstofverbruik tijdens de verschillende toestanden van de mitochondriale respiratie laten zien.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de skeletspieren, zoals het effect van verschillende interventies op de mitochondriële functie. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in het metabolisme van skeletspieren, kan ze ook worden toegepast op andere organen zoals de lever, hersenen, nieren of vrijwel elk ander weefsel. Bereid vóór aanvang van de procedure de volgende oplossingen voor om skeletspieren te isoleren: PBS, PBS plus 10 millimolar EDTA, mitochondriaal isolatiebuffer 8x, isolatiebuffer 1 of IB1, isolatiebuffer 2 of IB2 en experimentele buffer of EB.

Raadpleeg het bijbehorende geschreven protocol voor instructies. Zet vervolgens de centrifuge aan en stel deze in op 4 °C. Zet een waterbad aan en stel dit in op 37 °C.

Plaats drie bekerglazen van 10 milliliter, een potter-homogenisator, weefselmalers, een kleine chirurgische schaar en 10 microcentrifugebuisjes in een geschikte bak op ijs. Alles moet gedurende het gehele experiment ijskoud blijven. Plaats IB één en IB twee op ijs en EB in een warm waterbad.

Voeg vervolgens de volgende oplossingen toe aan de drie bekerglazen op ijs: beker één 10 milliliters PBS, beker twee 10 milliliters PBSEDTAs, beker drie 3 milliliters ib. 1. Euthanaseer een rat volgens de procedures die zijn goedgekeurd door uw lokale institutionele commissie voor dierenzorg en -gebruik.

Isoleer vervolgens snel 250 tot 500 milligram skeletspier met een pincet en Mayo-scharen. Spoel dit in beker één en breng het daarna over naar beker twee om de spier te homogeniseren. Breng het vervolgens over naar beker drie en hak het tot slot fijn met de schaar.

Overbreng de oplossing naar de Potter-Elva gem homogenisator en homogeniseer het spierweefsel 10 keer met een gemotoriseerde stamper, waarbij de buis constant in ijs wordt bewaard. Overbreng vervolgens het homogenaat naar vooraf gekoelde microcentrifugebuisjes van 2 mL en centrifugeer 10 minuten bij 700 Gs en 4 °C. Overbreng de supernatant naar een nieuw, vooraf gekoeld microcentrifugebuisje en discard het pellet.

Centrifugeer de S-supernatans bij 10.500 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius, breng de SNAT over naar een nieuwe, vooraf gevulde microcentrifugebuis en label deze als SN één en spiertype Reese. Suspendeer de pellet in 500 µL IB twee en centrifugeer vervolgens bij 10.500 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Breng de supernatant over naar een nieuwe, vooraf gevulde microcentrifugebuis en label deze als SN twee en spiertype.

Resuspendeer het uiteindelijke mitochondriële pellet in 100 µL IB twee. Centrifugeer dit enkele seconden in een minicentrifuge. Indien er een pellet aanwezig is, breng dan het supernatant over naar een nieuwe, vooraf gevulde microcentrifugebuis en gooi het pellet weg. De kalibratie van de zuurstofelektrode is een cruciale stap in dit protocol en moet dagelijks worden uitgevoerd.

De kalibratie van de elektrode kan worden voltooid tijdens de isolatie van de mitochondriën. Begin met het toevoegen van 100 milliliters gedestilleerd water aan een 250 milliliter kolf en roer krachtig gedurende 20 minuten. Om het water te equilibreren met atmosferisch gas, bedek de GRAT-elektrode met een paar druppels 50% kaliumchloride.

Plaats vervolgens een klein stukje blauw rizla-rolpapier op de elektrode. Leg daarna een stukje PTFE-membraan bovenop het rolpapier.

Breng de binnenring aan met de ringapplicator en plaats vervolgens de buitenring in de elektrodegroef. Sluit de elektroden aan en assembleer de grotere plastic ringbasis, de mitochondriële kamer en de waterslangen. Zet de GRAT-dozen aan en start de GRAS-software.

Voeg het geëquilibreerde water toe aan de mitochondriale kamer. Voeg vervolgens een roerstaf toe om het roeren in te schakelen. Klik op hardware.

Roer vervolgens op een bepaalde snelheid. Stel de snelheid in op 60 en klik op aan. Begin daarna een nieuw experiment.

Klik op kalibreren en vervolgens op kalibratie van de vloeibare fase. Wijzig voor vak één de temperatuur naar 37 °C en klik twee keer op oké. Wanneer 'override' verandert in oké, klik hierop en open de stikstoftank.

Plaats de tip die verbonden is met de stikstoftank in de kamer en creëer een zuurstofvrije omgeving. Klik op oké zodra er wordt overgeschakeld van de override-modus. Aspireer het water en voeg 500 µL EB toe aan de mitochondriale kamers.

Sluit de kamer af met een zuiger. Als er meerdere boxen worden gebruikt, herhaal dan de stappen vanaf de kalibratiestap voor elke box. Start een nieuw experiment en laat dit ongeveer één minuut lopen.

Om het signaal te stabiliseren, voegt u het benodigde volume mitochondriën-suspensie toe om op 150 micrograms per kamer uit te komen. Markeer de gebeurtenis en laat de meting lopen. Voeg gedurende één minuut 10 microliters warme 250 millimolar glutamaat en 125 millimolar malaat toe voor een eindconcentratie van vijf millimolar glutamaat en 2.5 millimolar malaat; markeer dit en laat de meting één minuut lopen.

Dit wordt gedefinieerd als toestand twee. Voeg vervolgens 7,5 µL van 10 mM a DP toe voor een eindconcentratie van 150 µM. Markeer dit vervolgens en laat het 30 seconden lopen.

Dit wordt gedefinieerd als staat drie. Voeg nog eens 7,5 µL van 10 mM ADP toe en laat het 1,5 minuut lopen. Voeg 0,5 µL koude 10 mM oligomycine toe voor een eindconcentratie van 1 µM en laat het drie minuten lopen.

Dit wordt gedefinieerd als toestand vier. Voeg één µL koude, 0,1 mM FCCP toe voor een eindconcentratie van 0,2 µM, en laat de RUM gedurende drie minuten lopen. Dit wordt gedefinieerd als toestand vijf.

Beëindig het experiment zodra dit is voltooid en sla het op. Bepaal de respiratiesnelheden met behulp van de raft-software. Voer de normalisatiefactor in.

Bij het toevoegen van 150 microgram mitochondrieel eiwit is de normalisatiefactor 0,15. Bereken de genormaliseerde respiratiesnelheden voor de verschillende respiratietoestanden. Bereken de respiratory control ratio of RCR door toestand drie te delen door toestand vier.

Deze figuur toont een representatieve registratie van het zuurstofverbruik door skeletspier-mitochondriën. Nadat het electrodesignaal is gestabiliseerd, wordt het mitochondriënmonster aan de GRAT-kamer toegevoegd. In staat twee begint de respiratie met de toevoeging van glutamaat en malaat.

Toevoeging van ADP verhoogt het zuurstofverbruik. Definiëren van status drie. Respiratie ATP-syntase wordt geblokkeerd door de toevoeging van oligomycine om status vier respiratie te verkrijgen.

Ten slotte wordt FCCP toegevoegd om de mitochondriale respiratie te ontkoppelen. Dit diagram toont representatieve zuurstofconsumptiesnelheden voor status 2, 3, 4 en vijf. De respiratoire controle ratio of RCR wordt voor elk experiment berekend.

Een RCR van meer dan vier wordt beschouwd als bewijs voor een levensvatbare mitochondriaal preparaat. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de mitochondriale monsters te allen tijde op ijs te bewaren. Volg deze procedure.

Andere methoden, zoals Western blots, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de inhoud van mitochondriale eiwitten. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe mitochondriën uit skeletspieren kunnen worden geïsoleerd, evenals van de mitochondriale respiratie.