Kwantificering van dsDNA het gebruik van de Hitachi F-7000 fluorescentie Spectrophotometer en PicoGreen Dye
5 november 2010
Demonstratie van kwantificering van dsDNA met behulp van Molecular Probes PicoGreen kleurstof en Hitachi F-7000 fluorescentie Spectrofotometer uitgerust met een microplaat reader accessoire.
Het algemene doel van deze procedure is om de capaciteit van de F 7, 000 fluorescentie-spectrofotometer met microplaatlezer aan te tonen voor het kwantificeren van dubbelstrengs DNA met behulp van Pico green-kleurstof. Dit wordt bereikt door eerst de monsters en reagentia voor te bereiden. De tweede stap van de procedure is het instellen van het instrument.
De derde stap van de procedure is het laden van de monsters in de microplatereader. De laatste stap van de procedure is het uitvoeren van de meting van de standaarden en monsters. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een lineaire kalibratiecurve tonen, welke kan worden gebruikt voor de kwantificering van dubbelstrengs DNA van onbekende monsters.
Zet de Hitachi F 7, 000 Spectra Fluorimeter aan zodat de Xenonlamp een uur kan opwarmen in Excel. Maak een bestand aan met de standaarden en monstergegevens en sla dit op in het formaat komma-gescheiden waarden of CSV. Klik om de fluorimeter in te stellen eerst op de methodeknop die het venster met de analysemethode opent.
Selecteer in het meetveld fotometrie in het uitklapmenu. Klik nu op het tabblad kwantificering. Selecteer in het veld kwantificeringstype golflengte om aan te geven dat de fluorescentiemeting zal worden uitgevoerd met een gespecificeerde golflengte.
Selecteer voor het kalibratietype 'first order' en selecteer voor het aantal golflengten 'one'. Voer nanogram per milliliter in als concentratie-eenheid. Zorg ervoor dat de selectievakjes voor 'manual calibration' en 'force curve through zero' niet zijn aangevinkt. Selecteer voor 'digit After decimal point' de waarde twee, voer nul in voor het veld 'lower concentration limit' en 10 000 voor het veld 'upper concentration limit'.
Klik vervolgens op het tabblad instrument en selecteer fluorescentie in het veld datamodus. Controleer of het veld chopsnelheid inactief is, aangezien dit alleen wordt gebruikt voor fosforescentiemetingen. Selecteer in het veld golflengtemodus beide WL fixed in het veld ex WL en voer 480 nanometer in het veld EM WL in.
Voer 520 nanometers in. Laat alle overige velden onder EX en EM inactief. Stel zowel de ex-spleet als de EM-spleet in op 5,0 nanometers.
Laat via de vervolgkeuzemenu's het selectievak vóór het veld PMT-voltage één tot 1000 volt leeg. Selecteer voor het PMT-voltage 700 volt in het vervolgkeuzemenu. Selecteer daarnaast twee voor het aantal automatische statistische berekeningen, één voor de herhalingen, 0.1 seconds voor de integratietijd en nul voor de vertraging.
Open nu het tabblad 'monitor' en stel het veld 'why axis max' in op 10 000 en 'why axis min' op nul. Selecteer vervolgens het vakje links van 'open data processing after data acquisition' en, indien gewenst, het vakje links van 'print report after data acquisition' voor een rapport dat automatisch moet worden afgedrukt na voltooiing van de metingen. Klik ten slotte op het tabblad 'general' en sla de geselecteerde parameters in de verschillende tabbladen van het venster voor de analysemethode op onder een nieuwe bestandsnaam op een opgegeven locatie.
Klik op de OK-knop om dit venster te sluiten. Hiermee is het instellen van de testparameters van het instrument voltooid. Om de microplaatlezer in te stellen, klikt u op de MPR-knop om het setup-venster voor de MPR naar voren te halen.
Selecteer eerst de wells voor de standaarden. Klik bijvoorbeeld op positie A1 en sleep de muis naar E1. Klik vervolgens op de knop voor de standaardset.
Hiermee worden de posities geselecteerd die voor de standaarden worden gebruikt, zoals aangegeven door de groene kleur. Selecteer vervolgens de posities voor de monsters. Klik op dezelfde manier en sleep de muis over de overeenkomstige posities op de plaat en klik vervolgens op de knop voor de monsterset, waarna de geselecteerde posities automatisch geel worden gemarkeerd.
Herhaal dezelfde handeling voor de posities van de gewenste monstermetingen. Om de standaarden en monsterinformatie in het eerder voorbereide csv-bestand te laden, klikt u op het tabblad 'well information' van het MPR-instellingsvenster.
Selecteer de knop voor de informatie over de laadputten; er opent nu een Windows Verkenner-venster om het .csv-bestand met putinformatie te selecteren. Na het laden van de informatie moet het venster als een tabel worden weergegeven. Om een werkoplossing van Pico green-reagens te bereiden, voegt u 50 µL 200 X pico green-reagens toe aan 9,95 mL TE-buffer.
Bereid voor de standaardcurve seriële verdunningen van Lambda dubbelstrengs DNA in TE-buffer voor eindconcentraties variërend van 1 tot 100 nanogram per milliliter; pipetteer 150 µL van elke standaard in de aangewezen wells van een 96-well plaat. Pipetteer vervolgens 150 µL van elk testmonster in de overeenkomstige aangewezen wells van de plaat. Voeg nu met een multichannelpipet 150 µL PicoGreen-oplossing toe aan elke well en meng de oplossing met de DNA-monsters.
Incubeer de plaat voorzichtig gedurende twee tot vijf minuten in een donkere ruimte om de reactie te laten ontwikkelen. Klik op de knop van het MPR-display om het instelvenster van de MPR bovenaan het scherm weer te geven en klik op de knop voor de uitwisselingspositie. Het platform voor de microplaat zal naar de voorzijde van het instrument bewegen; open de deur van de microplaatlezer en plaats de 96-wells plaat op het platform met well A1 naar voren, en sluit vervolgens de deur van de microplaatlezer.
Klik op de knop voor de beginpositie om positie A van de microplaat in de meetpositie te plaatsen. Klik op de knop voor het monitorischerm om het meetvenster bovenaan het scherm te tonen. Klik op de meetknop om te beginnen met het meten van de standaarden en de onbekende monsters.
Een goede kalibratiecurve wordt geëvalueerd aan de hand van de verschillende parameters die door de F 7, 000 software worden verstrekt. Zo heeft deze ideale kalibratiecurve, verkregen voor de kwantificering van dubbelstrengs DNA met behulp van Pico green-kleurstof, een berekende determinatiecoëfficiënt van 0,99993. Het beschreven high-throughput systeem is een seriële samenstelling van technologieën, waaronder Pico Green-kleurstof, een Hitachi F 7, 000 fluorescentiespectrofotometer uitgerust met een microplatelezer en een softwareprogramma om de gegevensverzameling, opslag, analyses en presentatie te automatiseren.
De combinatie van krachtige technologieën kan voorzien in de toenemende behoefte om kleine hoeveelheden dubbelstrengs DNA nauwkeurig te analyseren.
Overzicht
Dit artikel demonstreert de kwantificering van dubbelstrengs DNA (dsDNA) met behulp van PicoGreen-kleurstof en de Hitachi F-7000 fluorescentiespectrofotometer met een microplate-lezer. De procedure beschrijft de voorbereiding van monsters, de instelling van het instrument en de meetprocessen om een lineaire kalibratiecurve voor de kwantificering van dsDNA te verkrijgen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Fluorescentiespectroscopie
- DNA-kwantificatie
- Microplate-reader-technologie
Achtergrond
- PicoGreen-kleurstof is een gevoelige fluorescerende kleurstof die wordt gebruikt voor het kwantificeren van dsDNA.
- De Hitachi F-7000 is een veelzijdige fluorescentiespectrofotometer.
- Nauwkeurige DNA-kwantificering is essentieel voor diverse biologische experimenten.
- High-throughput-systemen vergemakkelijken de gelijktijdige analyse van meerdere monsters.
Doel van de studie
- Om de capaciteit van de F-7000 spectrofotometer aan te tonen voor de kwantificering van dsDNA.
- Om een betrouwbare methode vast te stellen voor het meten van onbekende DNA-monsters.
- Om een lineaire kalibratiecurve op te stellen voor een nauwkeurige kwantificering.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van het PicoGreen-reagens en DNA-standaarden.
- Instellen van de parameters van de Hitachi F-7000 spectrofotometer.
- Laden van monsters in de microplaatlezer.
- Meting van fluorescentie om een kalibratiecurve te genereren.
Belangrijkste resultaten
- Er werd een lineaire kalibratiecurve vastgesteld voor de kwantificering van dsDNA.
- De methode vertoonde een hoge gevoeligheid en nauwkeurigheid.
- De resultaten lieten een determinatiecoëfficiënt van 0,99993 zien.
- Het systeem analyseerde kleine hoeveelheden dsDNA effectief.
Conclusies
- De combinatie van PicoGreen-kleurstof en de F-7000 spectrofotometer biedt een robuuste methode voor DNA-kwantificatie.
- Deze high-throughput aanpak voldoet aan de eisen voor nauwkeurige analyse in biologisch onderzoek.
- De methode kan worden toegepast in diverse studies waarbij precieze DNA-metingen vereist zijn.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Nauwkeurige kwantificering van dubbelstrengs DNA is een fundamentele vereiste voor targetvalidatie, assayontwikkeling en het genereren van preklinische modellen in biofarmaceutische R&D. De Hitachi F-7000 fluorescentiespectrofotometer met PicoGreen-kleurstof maakt hooggevoelige high-throughput meting van dsDNA mogelijk, wat bijdraagt aan het betrouwbaar genereren van standaardcurves voor downstream toepassingen. Deze methode biedt voorspellende zekerheid bij de kwantificering van nucleïnezuren, waardoor de variabiliteit in vroege discovery-workflows wordt verminderd en schaalbare, reproduceerbare datagenerering mogelijk wordt gemaakt bij compound-screening en biomarkerstudies.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt nauwkeurige meting van dsDNA-concentraties mogelijk voor klonering, transfectie en PCR-gebaseerde assays voor targetvalidatie.
- Operationele waarde: Ondersteunt reproduceerbare monstervoorbereiding en kwantificering, waardoor technische variabiliteit in hypothese-gestuurde experimenten wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Genereert lineaire kalibratiecurves met hoge determinatiecoëfficiënten (R² > 0,999), wat zorgt voor een nauwkeurige kwantificering van onbekende monsters in studies naar target-interactie.
Screening & assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt kwantitatieve fluorescentie-uitlezingen die compatibel zijn met 96-well formats voor assay-standaardisatie en reagentia-titratie.
- Operationele waarde: Maakt snelle meting van 96 wells in minder dan 60 seconden mogelijk met behulp van de kinetiekmodus, wat de gereedheid voor high-throughput screening ondersteunt.
- Schaalbaarheid: De software maakt het mogelijk om microplaatconfiguraties op te slaan en terug te halen, wat een consistente assay-opzet tussen teams en projecten faciliteert.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Levert betrouwbare dsDNA-kwantificering voor biomarkeranalyse, PCR-validatie en vectorproductie in preklinische modellen.
- Risicobeheersing: Een hoge gevoeligheid (50 picomol fluoresceïne-equivalent) en een breed dynamisch bereik (5 grootteordes) maken nauwkeurige kwantificering over verdunningsreeksen mogelijk, waardoor fout-negatieve resultaten bij targets met een lage abundantie worden verminderd.
- Workflow-integratie: Exporteert gegevens naar Excel of rapportformaten, wat een naadloze overdracht naar bio-informatica- en analytische pipelines mogelijk maakt.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische ontwikkeling, waarbij een nauwkeurige kwantificering van nucleïnezuren essentieel is voor de reproduceerbaarheid van experimenten en de integriteit van de gegevens.
- Discoverybiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door nauwkeurige dsDNA-meting mogelijk te maken voor kloidningefficiëntie, genexpressieanalyse en mutagenesestudies.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve fluorescentie-outputs die de robuustheid van assays en de normalisatie van verbindingenbibliotheken ondersteunen.
- Analytiek: Genereert lineaire kalibratiecurven en determinatiecoëfficiënten (R²) die vergelijking tussen experimenten en kwaliteitscontrole mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit via betrouwbare kwantificering van DNA in geneesmiddelformuleringen, virale vectoren en biomarker-assays.
- Bedrijfsvoorzieningen en hergebruik: Configureerbare software en gestandaardiseerde protocollen maken hergebruik tussen afdelingen mogelijk, waardoor de herontwikkeling van methoden wordt verminderd en de operationele efficiëntie toeneemt.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Hoge sensitiviteit en specificiteit voor dsDNA verminderen valse signalen en verbeteren de betrouwbaarheid van de gegevens in moleculaire assays.
- Operationele waarde: Geautomatiseerde gegevensverzameling, opslag en presentatie via software minimaliseren handmatige handelingen en transcriptiefouten.
- Strategische waarde: Betrouwbare kwantificering ondersteunt go/no-go-beslissingen bij lead-optimalisatie door nauwkeurige dosering en normalisatie in functionele assays te garanderen.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering mogelijk door betrouwbare nucleïnezuurgegevens te leveren voor kandidaatselectie en formulatiestudies.
Overwegingen voor implementatie
- Kennis van fluorescentiespectroscopie en het bedienen van een microplate-lezer is vereist.
- Toegang tot een Hitachi F-7000 spectrophotometer met microplate-lezer accessoire en compatibele software is noodzakelijk.
- Gestandaardiseerde reagenspreparatie (verdunning van PicoGreen in TE-buffer) en monsterbehandeling zijn vereist om fluorescence quenching te voorkomen.
- Omvat optimalisatie van de incubatietijd (2–5 minuten in het donker) en golflengte-instellingen (Ex 480 nm, Em 520 nm) voor een consistente signaalwaarde.
- Omvat praktische beperkingen zoals de noodzaak voor incubatie in het donker en mogelijke interferentie door contaminanten of organische oplosmiddelen.
