Het identificeren van de effecten van BRCA1 mutaties op homologe recombinatie met behulp van cellen dat endogene wild-type BRCA1 Express

Het algemene doel van het volgende experiment is het testen op specifieke varianten in het BRCA1-eiwit met behulp van een in vitro homologe recombinatie-assay. Dit wordt bereikt door het endogene wild-type BRCA1-eiwit te vervangen door de variant die wordt getest via de transfectie van zowel short interfering RNA, specifiek voor BRCA1, als een plasmide voor de re-expressie van test-BRCA1-variant-eiwitten in cellen; als tweede stap worden het short interfering RNA en het plasmide voor de expressie van mutant BRCA1 getransfecteerd, samen met een plasmide voor de expressie van het I SCE1-eiwit, dat DNA-schade veroorzaakt op een specifieke locatie in het DNA-genoom van de testcel. Vervolgens worden de cellen twee tot drie dagen geïncubeerd om DNA-schade en herstel mogelijk te maken; er worden resultaten verkregen die aantonen of specifieke eiwitvarianten van het BRCA1-eiwit functioneren bij DNA-herstel door homologe recombinatie, gebaseerd op flowcytometrie-analyse van GFP-exprimerende cellen.

Deze techniek combineert twee gevestigde methoden om een veelzijdig systeem te creëren voor het analyseren van specifieke eiwitvarianten bij de herstelling van DNA-schade door homologe recombinatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat eerder gevestigde methoden steunden op cellijnen met een genetische knockout van BRCA1. Wij maken gebruik van een beter hanteerbare cellijn afgeleid van HELOC-cellen, die de depletie van BRCA1 mogelijk maakt via RNA-interferentie van het endogene eiwit, gevolgd door het terugvoegen van het testeiwit in deze cellen.

Nu we een variant van het BRC1-eiwit tot expressie brengen, kunnen we testen op homologe recombinatie. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege overmatige celdood tijdens de procedure. Het is belangrijk om de transsectiecondities zorgvuldig in te stellen, zodat het effect van de recombinatiereactie wordt gemaximaliseerd terwijl de cytotoxiciteit wordt beperkt.

Voorafgaand aan de start van dit protocol werd de hela DR 13 nine-cellijn gevestigd door hela-cellen te transfecteren met P-D-R-G-F-P. De cellijn wordt onderhouden op Petri-schalen van 10 centimeter in purmycine voor selectie van stabiel getransfecteerde cellen. Het recombinatiesubstraat in het P-D-R-G-F-P-plasmide en in de stabiele transformanten bevat twee inactieve allelen van GFP. Eén allel is inactief vanwege de aanwezigheid van de restrictie-enzymherkenningsplaats van 18 baseparen voor ISCE one.

In de coderende sequentie zorgt de expressie van ISCE one in deze cellen voor een dubbelstrengs DNA-breuk of DSB op het tweede allel van inactief GFP. Het deel van de sequentie dat correleert met de I SCE E one-site op het eerste allel is wild-type. Dit tweede GFP-allel kan fungeren als sequentiedonor voor homologe recombinatiereparatie van de DSP, wat zou resulteren in een actief GFP-allel, dat de dag vóór de eerste transfectie eenvoudig kan worden aangetoond via flowcytometrie.

Neem een schaal van 10 centimeter met HeLa DR 13-cellen die ten minste 90% confluent zijn. Trypsiniseer de cellen in 1 milliliter gedurende twee tot drie minuten. Stop de reactie door 9 milliliter DMEM-FBS toe te voegen en meng de cel-suspensie goed door te pipetteren. Voeg 40 microliters van de getrypsiniseerde cellen per putje van een 24-wells plaat toe in 0,5 milliliter DMEM-FBS. Incubeer de cellen gedurende de nacht bij 37 °C en 5% CO2.

Op dag één moeten de cellen een confluentie van tussen 40 en 50% hebben. Begin de transfectie door zowel het irna om endogeen b RCA one te depleteren als het B RCA one mutant-expressieplasmid in optimum media te mengen. Combineer vervolgens de nucleïnezuren met lip in optimum media.

Voer de lipectomie-transfectie uit volgens de instructies van de fabrikant na de transfectie. Plaats de cellen terug in de incubator. Vervang het medium vier tot zes uur later door medium dat geen antibiotica bevat.

Plaats de cellen op de tweede dag terug om een nacht te incuberen. Trypsiniseer de cellen door 0,3 milliliters TrypLE trypsin-reagens aan elke well toe te voegen. Na een korte incubatie bij 37 degrees Celsius worden de cellen losgemaakt door ze met een pipet herhaaldelijk op en neer te zuigen in het trypsin-reagens. Zodra de trypsinisering voltooid is, worden de cellen vanuit de 24-wells plaat overgebracht naar een 6-wells plaat met twee milliliters D-M-E-M-F-B-S om de trypsin-activiteit te stoppen.

Laat de zes-wellplaat overnacht incuberen onder dezelfde omstandigheden als voorheen, twee dagen na de initiële transfectie. Bereid de SIR A, het BRCA1-mutant-expressie-plasmide DNA en het ISCE1-expressie-plasmide voor in 62,5 µL Optum. Meng deze oplossing met 2,5 µL LIPECTOMY 2060 en 2,5 µL Optum.

Ga over tot transfectie van de cellen na een incubatie van vier tot zes uur. Vervang het medium door D-M-E-M-F-P-S zonder antibiotica. Plaats de cellen op dag zes terug in de incubator.

Trypsiniseer de cellen in elke well door 0,5 milliliters trypsin-reagens toe te voegen. Stop de reactie door twee milliliters D-M-E-M-F-B-S toe te voegen en verzamel de cellen door centrifugatie bij 1000 RPM gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de cellen in één milliliter vers D-M-E-M-F-B-S en analyseer 10.000 cellen per well op GFP-expressie.

Via flowcytometrie worden individuele levende cellen geselecteerd aan de hand van forward scatter- en size scatter-parameters. GFP-positieve cellen worden geïdentificeerd met de GFP-fluorescentiedetector en de resultaten worden weergegeven als een histogram. De overige cellen kunnen opnieuw worden uitgeplaat voor fluorescentiefotografie.

Microscopie van het gewenste BRCA1 reguleert de route voor herstel van dubbelstrengs DNA-breuken via homologe recombinatie. Cellen die herstel via homologe recombinatie hebben ondergaan, zijn eenvoudig te detecteren met fluorescentiemicroscopie. Depletie van BRCA1 door RNAi resulteert in een scherpe afname van de gedetecteerde GFP-positieve cellen.

De output van de FCA is een histogram met de GFP-intensiteit per cel op de x-as en het aantal cellen op de y-as. In afwezigheid van getransfecteerde, I SCE één expressieplasmid. Er worden geen GFP-positieve cellen gedetecteerd.

De resultaten in kolom twee tot en met zes zijn allemaal afkomstig van cellen waarin het ISC-één-expressieplasmide op dag drie was getransfecteerd. In een typische set resultaten van een enkel experiment zijn 15,5% van de cellen GFP-positief na ISC-één-expressie en controle-RNAi-depletie voor een irrelevant gen; ter vergelijking reduceert depletie van BRCA-één en het terugvoegen van een leeg plasmide-vector de GFP-conversie tot 0,7%. Toevoeging van exogeen wildtype BRCA-één herstelde de homologe recombinatie volledig, zoals aangetoond door het verkrijgen van 15 tot 16% GFP-positieve cellen.

Op soortige wijze werd de expressie van een andere variant met onbekende significantie, de BRCA1 21B-mutatie, volledig hersteld. De BRCA1-afhankelijke homologe recombinatiefunctie vertoonde na toevoeging van de BRCA1 M18T-mutant een vergelijkbaar effect als bij de vectorcontrole.

Aangezien deze variant op vergelijkbare niveaus werd tot expressie gebracht als het endogene eiwit, suggereert dit dat de BRCA1 M18T-variant niet functioneel is bij homologe recombinatie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de groei van de cellen te bewaken; de cellen groeien langzaam en bij een lage confluentie, waardoor de hoeveelheid gebruikte transfectiemengsel moet worden verminderd. Het is tevens belangrijk om het transfectiemedium tijdig te verwijderen.

We stellen vast dat er in de dagen na transfectie een hoge mate van cytotoxiciteit optreedt als er antibiotica in het medium zijn opgenomen. Om deze reden bevat al het medium na de eerste dag geen antibiotica meer. Na de ontwikkeling van deze techniek kregen onderzoekers op het gebied van borstkankeronderzoek de mogelijkheid om de genetica van BRCA1-varianten met onbekende klinische significantie in kankerclinieken te bestuderen.

We hopen dat de functionele BRC one-assay die in dit werk is ontwikkeld, zal bijdragen aan een verbeterde voorspelling van de effecten van BRC one-varianten op de aanleg voor kanker.