Computer-assisted Grootschalige visualisatie en kwantificering van eilandjes van Langerhans massa, afmetingen Distributie en Architectuur

Het algemene doel van deze procedure is om onbevooroordeelde representatieve gegevens te verzamelen binnen een beperkt monster en om de complexe driedimensionale structuur van het weefsel nauwkeurig te analyseren. Dit wordt bereikt door eerst virtuele coupes te maken van immunohistochemisch gekleurde pancreassecties. Vervolgens worden de virtuele coupes gekwantificeerd met de IHC virtual slice macro in ImageJ-software, waarna de gegevens worden geanalyseerd met scripts geschreven voor Mathematica.

Vervolgens wordt met behulp van Image J een 3D-reconstructie van de virtuele coupes uitgevoerd. De laatste stap van de procedure is het vastleggen van een stack van individuele eilandjesbeelden met de slide book-software en het handmatig in kaart brengen van de beeldstacks in drie dimensies met stereo investigator. Uiteindelijk kan de precieze architectuur van de eilandjes met 3D-coördinaten voor elke eilandjescel worden verkregen via een gecombineerde methode van 3D-beeldvorming en handmatige mapping. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van obesitas- en diabetesstudies, zoals hoe fysiologische en pathofysiologische omstandigheden de massa van de pancreatische bètacellen, de distributie van de eilandjes en de architectuur beïnvloeden.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de diagnose of therapie van obesitas en diabetes mellitus, aangezien een beter begrip van de veranderingen in de bètacelmassa de ontwikkeling en evaluatie van therapeutische interventies zal vergemakkelijken. Hoewel de methoden die in de huidige studie worden beschreven specifiek inzicht bieden in de dynamische immunohistochemische analyse van de pancreas, kunnen ze ook worden toegepast op een reeks andere organismen en weefsels. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, omdat de computerondersteunde analysestappen moeilijk aan te leren zijn.

Vanwege de complexiteit van het analyseren van dergelijke grote datasets in twee en drie dimensies. Begin deze procedure door een schoon objectglas met een volledige sectie van een immunohistochemisch gekleurde pancreas in de houder van een fluorescentiemicroscoop te plaatsen. Open de Stereo Investigator-software en visualiseer het monster door op acquisitie te klikken.

Neem vervolgens live beelden. Bepaal de belichtingsniveaus voor elk kanaal met behulp van het videohistogramvenster, waarin de fluorescentie-intensiteit wordt weergegeven. In dit voorbeeld wordt kanaal twee gebruikt voor DAP, kanaal drie voor GFP, kanaal vier voor RFP, kanaal vijf voor sci five en kanaal zes voor SCI seven.

Pas via het instellingenvenster van de camera het belichtingsniveau aan, zodat de fluorescentie-intensiteit afneemt. Aan de rechterkant van het videohistogram kan het beeld worden gescherpt met het focuswiel van de microscoop. Voordat u een virtuele coupe maakt, contoureet u het monster door op een punt op het scherm buiten het monster te klikken, wat als referentiepunt dient.

Klik vervolgens rond de omtrek van het monster wanneer de contour is voltooid. Klik met de rechtermuisknop en selecteer 'close contour' om het begin- en eindpunt te verbinden. Zodra de contour is gesloten, legt u een virtuele doorsnede van het monster vast door 'acquisition' te selecteren en vervolgens 'acquire virtual slice'. Wanneer de opties voor het venster van de virtuele doorsnede openen, selecteert u 'high speed acquire' en schakelt u 'manual' uit.

Stel de focus in door het vakje naast handmatig uit te vinken. Sla het bestand op. Kalibreer de prefo door met de rechtermuisknop te klikken en toevoegen aan focuslocatielijst te selecteren.

Stel handmatig de focus in voor verschillende willekeurige secties in de preview van de virtuele slice. Wanneer meerdere locaties in focus zijn gebracht, start de virtuele slice door met de rechtermuisknop te klikken en te selecteren: Start virtual slice with prefo. Nadat de virtuele slice voor het eerste monster is voltooid, schakelt u over naar het volgende kanaal en past u de belichting dienovereenkomstig aan. Deze procedure wordt voor elk kanaal herhaald om kwantificering van eyelets uit te voeren; verwerk de beelden met een ImageJ-macro genaamd I-H-C-V-S, die eerst de geladen beelden voorbereidt voor analyse en vervolgens kenmerken van eyelets, zoals de cellulaire samenstelling, kwantificeert.

De I-H-C-V-S macro's splitsen de stack in de respectievelijke kleurkanalen. In ImageJ wordt elke afbeelding omgezet in een zwart-wit masker van acht bit. Na automatische intensiteitsdrempelwaarde-bepaling worden de afzonderlijke kanaalafbeeldingen rekenkundig samengevoegd tot een samengesteld masker.

De ingebouwde particle-analyse van Image J op de composietafbeelding identificeert vervolgens regio's van belang of ROI's, waarbij particles die kleiner zijn dan één bètacel worden uitgesloten. De kwantificatie van ROI's met Image J resulteert in een spreadsheet met celparameters.

Sla de geaggregeerde resultaten op in een Excel-spreadsheet. Sla gegevens op zoals oppervlakte, omtrek, circulariteit, Feret-diameter en het centrum van elk oogje, samen met de corresponderende nummers zoals aangegeven in de afbeelding. De computationele analyse van deze parameters kan worden uitgevoerd zoals beschreven in het geschreven protocol. Om informatie te onthullen, waaronder de distributie en frequentieanalyse van de oogjes, voert u een 3D-reconstructie van virtuele coupes uit door een script te draaien dat alle JP2-afbeeldingen in de map converteert naar TIF-bestanden; dit is het formaat dat wordt gebruikt voor de constructie en kwantificering van driedimensionale stacks vanuit de virtuele coupes.

Hier wordt een script genaamd I MJ two two tiff gebruikt. Kopieer het script naar de directory die de JP two-afbeeldingen bevat. Voer het script uit met de Linux shell door dot slash I am JP two two TIFF in de console te typen en vervolgens op enter te drukken.

Wanneer alle vastgelegde beelden zijn geconverteerd van JPEG2 naar TIFF-bestanden, kunnen ze worden gebruikt voor analyse in ImageJ. Open met ImageJ alle beelden van het eerste monster, dat in dit geval afkomstig is van een menselijke foetale pancreas, en voeg deze samen tot één beeld door Image, Color en vervolgens Merge Channels te selecteren. Herhaal dit proces voor elk van de monsters. Wanneer alle monsters zijn samengevoegd tot enkele beelden, kunnen deze worden opgeschoond door ongewenste regio's te selecteren met de Polygon Selections-tool.

Vul deze in door 'edit' en vervolgens 'fill' te selecteren. Converteer elke afbeelding naar een RGB-kleurafbeelding. Maak tot slot een stack van de afbeeldingen, waarna deze verder kunnen worden uitgelijnd met de stack reg-plugin.

Uiteindelijk creëert het samenvoegen van de kanalen en het combineren van de beelden een 3D-montage van alle oogjes in de gehele pancreas. Om beeldstacks te verzamelen, plaatst u de whole mount pancreas-oogjes onder de microscoop. Voeg water toe indien u gebruikmaakt van een waterimmersie-objectief.

Open de software van het objectglassysteem, ga naar de opname- en focusbediening door op Ctrl + Shift + E te drukken in het focusbedieningsvenster. Stel het objectief in op 20x of 40x, afhankelijk van de grootte van het oogje. Om het oculair van de microscoop te gebruiken om de oogjes te lokaliseren, stelt u de binoculaire vergroting in op 2x en de filterset op user 1.

In het venster voor de focusregeling moet de emissieselectie worden ingesteld op 100%Eyes; de neutrale dichtheid moet worden ingesteld op één klik GFP ey, waarna de vloer wordt geopend om het monster in slide book te visualiseren. Keer terug naar het venster voor de focusregeling en schakel de filterset over naar fix. Klik vervolgens op G-F-P-D-S. Gebruik de joystick om het oogje in het venster van camera één zo goed mogelijk te centreren.

Stel de focus in op een diepte nabij het midden van het oogje waar de cellen gemakkelijk te onderscheiden zijn. Selecteer in het venster voor focusregeling de zab. Gebruik de scope-regeling om naar de bovenste diepte van het oogje te scrollen waarin kenmerken duidelijk te onderscheiden zijn, en klik op set top.

Scroll naar de onderkant van het oogje en klik op set. Klik onderaan op go. Om terug te keren naar het referentiepunt in het acquisitievenster, klikt u op advanced en vervolgens op alternate bij de kanaalmodus.

Stel de bin factor in op twee keer en het capture-type op 3D aan de rechterkant van het venster, klik op 'use top and bottom positions' en 'return to center volume after capture'. Stel de stapgrootte in op drie. Stel de filterset in op 'live' onder het vak voor de filterset.

Selecteer DAP, E-D-S-U-G-F-P-D-S-U-R-F-P-D-S-U en SCI vijf DSU. Klik voor elk van deze op 'find best' onder 'adjust exposure'. Klik vervolgens op 'test' om te controleren of de geselecteerde belichting geschikt is.

Klik op start om de opname te beginnen. Wanneer de opname is voltooid, past u de niveaus naar behoefte aan en wijzigt u de weergegeven kleur voor RFP naar wit. Sla de slide op en ga naar het bekijken van de geëxporteerde TIFF-serie.

Typ de naam van de slide in met een koppelteken aan het einde en sla deze op. Er worden tientallen individuele TIF-bestanden aangemaakt, dus het kan handig zijn om elke image stack van de oogleden in een aparte map te bewaren. Open de stereo investigator-software om de image stacks in kaart te brengen.

Visualiseer de afbeelding door de afbeeldingsstacks in het menu voor beeldschaling te openen. Stel de afstand tussen de afbeeldingen in op drie micron om te corrigeren voor een tweevoudige buiging. Selecteer in het slide-boek de optie om de X- en Y-schaling te overschrijven en gebruik een gespecificeerde waarde voor de bron van de X- en Y-schaling.

Voer 0,65 in voor zowel het X- als Y-centrum en zoom in op de afbeelding door op de zoomknop te klikken; markeer vervolgens in het midden van de iris van belang in het macrovenster ten minste één cel. Bij gebruik van de juiste marker zullen bètacellen groen verschijnen. Alfacellen zullen rood verschijnen en deltacellen zullen wit verschijnen.

Markeer de cellen in het centrum van hun kern, die blauw zullen verschijnen als het monster is gekleurd met DPI. Gebruik Marker twee om bètacellen te markeren, Marker vijf voor alfacellen en Marker zes voor deltacellen. Zodra er ten minste één cel is gemarkeerd, wordt het orthogonale beeld weergegeven met behulp van het pictogram in het bovenmenu; vink Z filter en symmetric aan.

Het bereik moet worden ingesteld op 15.00. Begin bij 0.0 Z. Scroll met het muiswiel door de oogjes en markeer elke cel met de juiste marker; markeer elke cel slechts één keer in het midden van de diepte. Nadat alle Z-niveaus zijn gemarkeerd, kan het selectievakje voor het Z-filter worden uitgevinkt.

Dit zal alle markeringen van alle Z-niveaus tonen. Wanneer elke cel is gemarkeerd, slaat u het bestand op als een DAT-bestand. Ga vervolgens naar file export tracing.

Sla de tracing op als een TXT-bestand. Klik tot slot op 'new data file' om de werkruimte leeg te maken voordat u probeert nieuwe eyelets in kaart te brengen. De bereiding van virtuele coupes uit een immunohistochemisch gekleurd pancreasmonster maakt het mogelijk om de alfa-, bèta- en deltahormoonproducerende endocriene cellen in de gehele pancreas samen als eilandjes te onderzoeken; de immunohistochemische kleuring voor insuline is in het groen te zien, glucagon in het rood, somatostatine in het wit en dap in het blauw.

De beelden werden vervolgens na automatische drempelwaarde-bepaling omgezet in een 8-bits masker. Hier wordt het samengestelde merge-beeld getoond. De distributie van oogjes met behulp van virtuele coupes maakt echter ook individuele analyse in afzonderlijke kanalen mogelijk.

Hier worden weergaven van elk kanaal getoond om de deltacellen, betacellen en alfacellen te onthullen. De partikelanalyse is uitgevoerd op een samengesteld masker waarop elke eyelet-structuur genummerd en blauw gemarkeerd is. De partikelanalyse van de samengestelde maskers wordt uitgegeven als een datatabel met parameters zoals het oppervlak, de omtrek en de circulariteit van de eilanden, evenals diverse diameters voor elke gedetecteerde eyelet, met ID's die overeenkomen met de genummerde labels op het samengestelde masker.

De grootschalige analyse van deze beelden resulteert in de productie van histogrammen van het totale aantal eilandjes en de grootteverdeling, evenals gedetailleerde vergelijkingen van de oppervlakten van alfa-, bèta- en deltacellen. Mapping van de eilandjes en mathematische analyse van de cellulaire samenstelling en architectuur kunnen een enkel brandvlak onthullen uit een 3D-gereconstrueerde stapel beelden van menselijke eilandjes die zijn geüpload in Stereo Investigator. Hier zijn de bètacellen in het groen, de alfacellen in het rood, de deltacellen in het wit en de kernen in het blauw.

Na de acquisitie van verschillende eylets worden alfa-, bèta- en deltacellen hier op diverse diepten gemarkeerd; fluorescente beelden en de bijbehorende kaartgegevens worden getoond voor drie verschillende brandvlakken met een interval van 10 microns. Zodra de alfa-, bèta- en deltacellen op diverse vlakken zijn gemarkeerd, kan het eylet in 3D worden gevisualiseerd. Hier wordt een 3D-reconstructie getoond van het in kwarten gesneden eylet, gebaseerd op coördinaten verkregen via eylet-mapping.

Bovendien kan een geautomatiseerde wiskundige analyse van in kaart gebrachte eyelets de cellulaire samenstelling en architectuur weergeven. Hier wordt de relatieve frequentie van cel-celafstanden tussen twee cellen in een enkele celpopulatie getoond. Ook wordt de relatieve frequentie van cel-celafstanden tussen twee verschillende celpopulaties weergegeven.

Ook worden de cumulatieve waarschijnlijkheden van cel-tot-cel-afstandverdelingen voor alfa-naar-alfa-, bèta-naar-bèta- en delta-naar-delta-cellen getoond. De Kolmogorov-Smirnov- of KS-test kan op deze waarschijnlijkheden worden uitgevoerd om de overeenkomstige KS-afstanden te verkrijgen. Zodra dit beheerst is, kan grootschalige beeldvorming en analyse van een volledige weefselcoupe in vier uur worden uitgevoerd.

3D-reconstructie van een weefselblok kan in 30 minuten worden voltooid. Ten slotte kunnen 3D-beeldvorming en handmatige mapping in vier uur worden afgerond als dit correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te beginnen met een hoogwaardige immunohistochemische kleuring van de coupes.

De nauwkeurigheid van de daaropvolgende analyse is volledig afhankelijk van de ruwe data. Zorg er daarnaast voor dat uw computers ten minste acht gigabytes RAM hebben om een analyse van deze omvang te kunnen verwerken. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers, niet alleen op het gebied van obesitas en diabetes, maar breed in vele andere vakgebieden die gebruikmaken van de standaard pathologische analyse.

Dit kan bijzonder nuttig zijn wanneer de beschikbaarheid van monsters beperkt is. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u onbevooroordeelde representatieve gegevens verzamelt binnen een beperkte steekproefomvang met behulp van standaardtechnieken. Het selecteren van slechts een specifiek gebied is mogelijk niet representatief voor het volledige beeld, zoals we hebben aangetoond in onze studie naar de distributie van pancreaseilandjes.