Gist Colony integratiemethode

Het algemene doel van deze procedure is het inbedden van gistkolonies. Dit wordt bereikt door eerst een kolonie en de onderliggende agar van een agarplaat te verwijderen, deze op enkele druppels gesmolten agar te plaatsen en vervolgens snel te bedekken met meer gesmolten agar. Daarna wordt het overtollige agar rond de kolonie afgesneden om deze klein genoeg te maken om in een vorm te passen.

De ingebedde AER-kolonie wordt vervolgens gefixeerd, gekleurd, gedehydrateerd en tot slot geïnfiltreerd met spurs-hars. Het blok wordt vervolgens in een vorm met extra spurs-hars geplaatst, geïncubeerd tot het is uitgehard en daarna gesneden. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de distributie van celtypen binnen een gistkolonie tonen via licht- of elektronenmicroscopie.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals scanning elektronenmicroscopie, is dat het mogelijk maakt om de interne structuur van de kolonie te bepalen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van microbiële ontwikkeling, zoals de distributie van celtypen binnen kolonies. Deze methode bood inzicht in de structuur van croce CAC-kolonies, maar het is waarschijnlijk dat deze ook kan worden toegepast op andere micro-organismen.

Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien het hanteren en inbedden van kolonies moeilijk te leren kan zijn aan de hand van een geschreven protocol. Het idee voor deze methode werd geïnspireerd door genetische gegevens die we in 2002 publiceerden, waaruit bleek dat sporen niet gelijkmatig over de kolonies waren verdeeld. We hebben een methode voor het doorsnijden van kolonies aangepast die was ontwikkeld door Engelberg in het Fin-lab.

Laten we beginnen. Begin met het incuberen van Wild S visi gist op auger-platen bij 30 °C totdat er ongeveer 300 kolonies aanwezig zijn. Verwijder met een smalle spatel één voor één kolonies met een diameter van één tot twee millimeter van de plaat.

Plaats vervolgens met een pipetteertip van 1 ml enkele druppels 2% agar bij 42 °C op een microscoopglasplaatje, en plaats de kolonie onmiddellijk met de agarzijde naar boven op het glas voordat de AER stolt. Plaats nog enkele druppels agar op de kolonie en laat de agar stollen; zorg ervoor dat de gehele kolonie, inclusief de bovenkant, volledig is ingesloten in agar. In alle volgende protocolstappen met een scheermesje.

Trim het AER rond de kolonie en plaats het AER-blok met de kolonie in een schroefdopbuisje van borosilicaatglas van 3,5 milliliter dat 2% paraformaldehyde en 2% glutaaraldehyde fixatief bevat. De kolonies moeten één voor één worden verwerkt om uitdroging te voorkomen, maar er kunnen tot 10 kolonies in hetzelfde buisje worden geplaatst. Laat de kolonies zeven dagen rusten bij vier graden Celsius.

Verwijder na één week het fixatief en was de agri-kolonies twee keer met ongeveer 1,5 milliliters 0,15 molar natriumcate bij pH 7,2 en incubeer na elke wasbeurt 15 minuten op ijs zonder agitatie. Voer deze wasbeurt daarna nog twee keer uit.

Gebruik 1,5 milliliters van een een X OS-buffer, bestaande uit 100 millimolar monokaliumfosfaat en 10 millimolar magnesiumchloride bij pH 6,0, waarbij na elke wasbeurt vijf minuten op ijs wordt geïncubeerd. Voer vervolgens, met gebruik van hetzelfde flacon, de osmiumbehandeling en de wasbeurten uit die hier en in het geschreven gedeelte van dit protocol worden vermeld. Voer daarna opnieuw, in hetzelfde flacon, de stapsgewijze dehydrataties uit die hier en in het bijbehorende geschreven protocol worden beschreven, vroeg de volgende ochtend.

Bereid het spurs-reagens voor zoals hier getoond en in het bijbehorende geschreven protocol. Was de agri-blokken onmiddellijk vijf keer gedurende elk 10 minuten met 1,5 milliliters 100% ethanol op kamertemperatuur. Verwijder na de laatste ethanolwas slechts voldoende ethanol zodat het agri-blok bedekt blijft.

Breng met een pasteurpipet ongeveer 0,5 milliliters spurs-reagens aan in het vial en roteer dit 15 minuten op lage snelheid op een rotatieapparaat. Laat het vial na rotatie 30 minuten staan bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de oplossing volledig.

Voeg vervolgens 1,5 milliliters spurs-reagens toe om het agri-blok te bedekken. Roteer het vial opnieuw 15 minuten op een wiel bij kamertemperatuur en laat het 30 minuten staan. Herhaal deze wasstap.

Herhaal deze stap nog drie keer. Verwijder na de laatste 30 minuten het spurs-reagens en voeg vers spurs-reagens toe om de blokken te bedekken. Laat de agri-blokken vier uur bij kamertemperatuur staan.

Vervang het spurs-reagens en laat dit een nacht roteren. De volgende ochtend wordt het spurs-reagens opnieuw vervangen; laat de vials roteren tot de volgende dag. De daaropvolgende ochtend wordt het spurs-reagens in genummerde siliconen mallen gegoten, zodanig dat de bodem van de mallen net bedekt is.

Plaats vervolgens de agri-blokken in de vormen en incubeer deze gedurende vier uur bij 60 °C. Vul de vormen na vier uur aan met meer spurs en reagens, en incubeer deze gedurende de nacht bij 60 °C. Verwijder de blokken uit de vorm voor het maken van coupes.

Hier is een voorbeeld van een lichtmicrofoto van een doorsnede door het centrum van een colony van Wild S Visia gist. Deze gist is een wildtype-stam die is geïsoleerd uit boomexudaten. De kolonie werd zes dagen lang geïncubeerd op YNA-medium voorafgaand aan het maken van de doorsnede.

In deze afbeelding zijn asai, pseudo-hyfen en ovoïde gisten gemakkelijk te onderscheiden, en het gebied van de kolonie dat de onderliggende agar binnendringt is ook duidelijk zichtbaar. Open pijlen geven representatieve asai aan, gevulde pijlen geven representatieve ovoïde vegetatieve cellen aan en gevulde pijlpunten geven ketens van verlengde cellen en si aan. Deze afbeelding is een voorbeeld van een elektronenmicrografie van een dunne sectie van een laboratoriumstam van gist SH 1 0 2 0, en W 3 0 3.Achtergrond.

De kolonie werd zes dagen lang geïncubeerd op YNA-medium voordat deze in secties werd gesneden. De afbeelding toont een gebied van de kolonie met een hoge frequentie van gesporuleerde cellen. Een pijl geeft de dubbellaagse structuur van de sporewand aan.

In deel A tonen we een doorsnede van een vierdaagse kolonie met een raster bestaande uit 15 rechthoeken dat over de afbeelding in deel B is geplaatst. De frequentie van spore-gerelateerde cellen in elke rechthoek is uitgezet met 15 staven die overeenkomen met de 15 rechthoeken getoond in deel A. De gegevens zijn het gemiddelde en de standaardfout van vier onafhankelijke vierdaagse koloniën. In deel C worden de gemiddelden en standaardfouten voor vier onafhankelijke achtdaagse koloniën getoond. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in twee weken worden uitgevoerd, met één volledige dag en meerdere dagen van één tot drie uur. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de oplossingen onmiddellijk toe te voegen, zodat de blokken na deze procedure niet uitdrogen.

Andere methoden, zoals immuno-elektronenmicroscopie, zouden mogelijk kunnen worden gebruikt om de distributie van cellen te bepalen die specifieke eiwitten tot expressie brengen na de ontwikkeling ervan. Deze techniek stelde ons in staat om niet alleen naar het patroon van sporulerende cellen te kijken, maar ook naar het patroon van pseudo-hyfale cellen in croce CCI-kolonies. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe gistkolonies moeten worden ingebed voor coupesnijden.

Vergeet niet dat veel van de microscopiereagentia die in dit protocol worden gebruikt, uiterst gevaarlijk kunnen zijn. Denk eraan om een zuurkast te gebruiken, beschermende kleding te dragen en de reagentia op de juiste wijze af te voeren. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken. Veel succes met uw experimenten.