Bio-energetische Profiel Experiment met behulp van C2C12 myoblast Cellen

Het algemene doel van het volgende experiment is om de functionele status van mitochondriën in levende cellen en geïsoleerde mitochondriën te testen door meerdere parameters van het oxidatieve metabolisme te meten met de XF 96 extracellular flux analyzer. Deze parameters zijn de basale respiratie, ATP-omzetting, protonlek en de maximale respiratie of reserve-respiratoire capaciteit. Dit wordt bereikt door opeenvolgend specifieke modulatoren van de mitochondriale respiratie toe te voegen aan C2C12-myoblastcellen en de verandering in de zuurstofconsumptiesnelheid, of OCR, een indicator van respiratie, en de omzetting van glucose naar lactaat, waarbij ATP via glycolyse wordt gegenereerd, te meten.

De andere belangrijke energiepad in cellen wordt eveneens gemeten als ECAR of extracellulaire verzuringssnelheid. Er kunnen resultaten van mitochondriale profilering worden verkregen die inzicht geven in de centrale rol die de mitochondriale functie speelt bij het bepalen van de levensduur van cellen. Hallo, mijn naam is David Nichols.

Gedurende mijn gehele carrière ben ik een mitochondriale kunstenaar geweest en het belangrijkste instrument dat ik in mijn studies heb gebruikt, is de zuurstofelektrode. Wanneer u de snelheid van de zuurstofopname onder verschillende condities met geïsoleerde mitochondriën kunt meten, verkrijgt u een enorme hoeveelheid cruciale informatie. Wanneer u overstapt op cellen, met name cellen die worden gekweekt in een multi-wellplaat of op een dekglasplaatje, werken de klassieke methoden niet.

Dit is een groot probleem, dat enkele jaren geleden werd opgelost door de ontwikkeling van een multi-well plaat assay, waardoor we de respiratie van cellen parallel in een multi-well plaatformaat kunnen bestuderen. Wat u vandaag zult zien is een zeer eenvoudig maar informatierijk experiment, dat we hebben ontworpen om de basisstroom van mitochondriale bioenergetische functies in gekweekte cellen te monitoren. Begin met het uitplaten van cellen in XF 96 celkweekplaten met 10.000 cellen per well in 100 µL groeimedium en plaats deze in een incubator van 37 °C met 10% CO2.

De cellen kunnen worden geanalyseerd in de XF 96, 24 uur na het uitplaten met behulp van de assay. De Wizard genereert een sjabloon met de volgende groepsindeling. Kolommen één tot en met 12 bevatten elk 10.000 C two C 12-cellen.

Groep één in het blauw wordt gebruikt als controlecellen. Groep twee in het rood krijgt de geneesmiddelen oligomycine, FCCP en rotenon toegediend. Bereid vervolgens de verbindingen in X-F-D-M-E-M assay-medium voor zoals beschreven in het geschreven gedeelte van het protocol.

Oligomycine, FCCP, rotenon. Deze verbindingen zijn vooraf gedoseerd in de XF cell MIT stress test kit. Vervang met behulp van het XF prep station het groeimedium door DMEM runmedium.

Incubeer de cellen tot slot 60 minuten in een incubator van 37 °C zonder kooldioxide, zodat de cellen vooraf kunnen equilibreren met het assay-medium. Breng de injecteerbare verbindingen voor het toevoegen aan de sensorkartridge op 37 °C. Laad ze vervolgens als volgt in de injectiepoorten. Laad voor kolommen één tot en met vier respectievelijk 16, 18 en 20 µL XF assay-medium of DMEM in poorten A, B en C.

Laad voor kolommen vijf tot en met 12 16 µL oligamycine in poort A, 18 µL FCCP in poort B en 20 µL rotenon in poort C. Definieer vervolgens de protocolcommando's: stel de loop in op drie keer, het mengen op drie minuten en de meting op drie minuten. Klik daarna op start.

Volg de instructies op het scherm die de gebruiker aangeven wanneer de cartridge geplaatst moet worden zodra de kalibratie is voltooid. Volg de aanwijzingen en plaats de celplaat voor het experiment. Klik vervolgens op doorgaan en laat de assay verlopen.

Verwijder de plaat wanneer het experiment is beëindigd. Deze assay is afgeleid van het klassieke experiment om de mitochondriale functie te profileren en dient als een raamwerk om complexere experimenten op te zetten die gericht zijn op het begrijpen van de effecten van verschillende verbindingen op het celmetabolisme, de mitochondriale functie en de algemene bio-energetische activiteiten. Hier observeerden we de verwachte respons in de zuurstofconsumptiesnelheid terwijl de cellen werden behandeld met elke opeenvolgende verbinding.

Voor ligamycine nam de OAR af als gevolg van het blokkeren van de ATP-synthese bij mitochondriaal complex vijf. Omdat de cellen na een ligamycine-behandeling niet in staat waren om ATP te synthetiseren via oxidatieve fosforylering, schakelden ze over op glycolyse om aan hun behoefte aan ATP te voldoen. Hierdoor observeerden we een toename in ECAR, de extracellulaire verzuringssnelheid, een indicator voor glycolyse zoals eerder aangetoond. FCCP werkt als een ontkoppelingsmiddel en heft de beperking van de protonenterugkeer op.

De respiratie versnelt en wordt nu beperkt door het elektronentransport. Tot slot remt rotenon het mitochondriale complex I, waardoor de elektronenstroom in de elektronentransportketen stopt en het zuurstofverbruik drastisch wordt verminderd. Hierbij wordt informatie verkregen over de basale respiratie van de cellen, het percentage zuurstofverbruik dat wordt besteed aan de ATP-productie, evenals de hoeveelheid die wordt besteed aan het in stand houden van de protongradiënt als gevolg van protonlekkage.

Bovendien kunnen we de maximale ademhalingssnelheid bepalen onder omstandigheden van ontkoppelde respiratie, wat soms wordt aangeduid als de reserve-respiratoire capaciteit. En tot slot kunnen we de hoeveelheid zuurstofverbruik bepalen die niet het gevolg is van mitochondriale processen. Dit heeft u zojuist gezien met de Seahorse.

XF 96 is een reeks experimenten die een enorme hoeveelheid informatie verschaft over de bioenergetica van de mitochondriën in de cel. Het basisexperiment, dat van groot belang is en dat we experiment nummer één noemen, geeft informatie over de basale respiratie, de ATP-omzetting, het mitochondriale protonlek en de reserve-respiratoire capaciteit. Deze parameters leveren deze fundamentele informatie over de bioenergetische status van de mitochondriën in de cel.