Een analytisch instrument-box voor de Uitgebreide Biochemische, structurele en Transcriptome Evaluatie van orale biofilms gemedieerd door mutans streptococcen

Biofilms die zich op tandoppervlakken vormen, zijn uiterst complex en gestructureerd. Het betreft microbiële gemeenschappen ingebed in een extracellulaire matrix, die voortdurend worden blootgesteld aan omgevingsfactoren. Het algemene doel hier is om twee specifieke componenten van een analytische gereedschapskist te presenteren die is ontworpen om structurele en moleculaire studies te vergemakkelijken, waarbij rekening wordt gehouden met de complexe aard van orale biofilms door een nieuwe fluorescentie-imagingtechniek te combineren met op maat gemaakte software voor gegevensverwerking en -analyse.

Dit wordt bereikt door eerst specifieke assays te selecteren voor de analyse van biofilm, transcriptoom en structuur, waaronder een nieuwe confocale beeldvormingsmethode voor gelijktijdige visualisatie van EPS en bacteriën. De tweede stap van de procedure is het verzamelen van de ruwe gegevens uit de bioassays. De derde stap is het verwerken van de ruwe gegevens met specifieke software, waaronder de recent ontwikkelde duo stat voor colocalisatieanalyse.

De laatste stap is het analyseren van de procesgegevens, inclusief het gebruik van software voor microarray-datamining en -organisatie, zoals de Microarray Data Visualizer of MDV. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die laten zien hoe orale pathogenen hun transcriptoom en de architectuur van de biofilms veranderen als reactie op een complex dieet en interacties met de microben van de gastheer met behulp van onze unieke geïntegreerde analytische toolkit, wat een meer uitgebreide biofilm-analyse en interpretatie van gegevens mogelijk maakt. Hallo, mijn naam is Michelle Kuh, universitair hoofddocent bij het Center for Oral Biology hier aan het University of Rochester Medical Center.

Vandaag presenteren wij een analytische toolbox voor biofilm-analyse. Deze toolbox kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van biofilm-onderzoek, zoals de structuur van biofilmcellen, hun ordening ten opzichte van de extracellulaire matrix en hoe zij op transcriptoomniveau reageren op complexe omgevingsuitdagingen. Mijn naam is Jean, ik ben postdoc-onderzoeker in het laboratorium van Dr. Ks.

Vandaag ga ik het beeldvormingsgedeelte van onze toolkit demonstreren. Hoi, ik ben Aise Klein. Ik ben research assistant professor in het laboratorium van Dr. Ks.

Vandaag presenteer ik de MDV-software voor de analyse van microray-gegevens. In deze procedure worden met speeksel gecoate hydroxyapatiet-schijfjes gebruikt als surrogaat voor het tandoppervlak waarop biofilms worden gekweekt. Voeg eerst 2,8 milliliters kweekmedium geïnoculeerd met S mutants toe aan elke put van een 24-puts plaat; bescherm de plaat tegen licht. Voeg aan elke put dextrine-geconjugeerde LOR 6 47-kleurstof toe tot een eindconcentratie van 1 micromolar en pipetteer dit meerdere keren op en neer om de kleurstof in het kweekmedium te mengen.

Dip en was vervolgens de steriele, met speeksel gecoate hydroxyapatiet-schijfjes met een steriele pincet twee keer in steriele AB-buffer om overtollig speeksel of ongebonden speekselcomponenten te verwijderen. Plaats de schijfjes daarna verticaal in het met kleurstof aangevulde kweekmedium, waarbij u ervoor zorgt dat elk schijfje volledig is ondergedompeld. Dek de plaat af met aluminiumfolie en incubeer deze 20 uur lang bij 37 °C in een incubator met 5% CO2, zodat de biofilms kunnen vormen en de geconjugeerde textuur kan worden geïncorporeerd in de exopolysachariden die door de bacteriële cellen worden geproduceerd.

Om de bacteriële cellen te labelen, bereidt u eerst een 24-wells plaat voor met 2,8 milliliters steriel milli Q-water per well. Voeg 1,5 microliters cyto nine-kleurstof toe aan elke well tot een eindconcentratie van één micromolar en bescherm de plaat tegen licht. Zodra de biofilm is gevormd, haalt u de plaat met de schijfjes uit de incubator.

Was elke schijf in een oplossing van 0,89% natriumchloride. Breng ze vervolgens over naar de nieuwe plaat met de cyto nine-kleurstof. Dek de plaat af met aluminiumfolie en incubeer deze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

Zodra de cellen zijn gekleurd, worden de biofilms ondergedompeld en gewassen in natriumchloride zoals voorheen. Laat vervolgens de biofilms met een pincet van het draad in een Petrischaal met natriumchloride glijden. Wikkel de Petrischaal in aluminiumfolie.

De biofilmen zijn nu klaar voor visualisatie via confocale microscopie met behulp van een laser-scanning confocale microscoop. Scan elke biofilm op vijf tot 10 willekeurig gekozen posities en genereer op elke positie een Z-serie. Open de confocale beelden en verwerk deze met een mirror-software om 3D-reconstructies mogelijk te maken.

Deze driedimensionale weergave van confocale beelden, geproduceerd met het programma Amira, toont een biofilm van S-mutanten die is gevormd op het apathische oppervlak met behulp van de gedemonstreerde procedure. Bacteriële cellen en microkolonies zijn zichtbaar in het groen en zijn ingebed in de biofilmmatrix die exopolysachariden bevat. In het rood kan een detailweergave van een geselecteerd gebied worden gegenereerd, waarin de specifieke structurele relatie tussen de bacteriën en de EPS op microschaal wordt geïllustreerd.

Gebruik het duos stat-programma om de mate van colokalisatie van afzonderlijke biofilmcomponenten, zoals de bacteriën en de exopolysachariden, te kwantificeren. Stel eerst het pad van de nieuw ontwikkelde duo stat in MATLAB versie 5.1 in en open de afbeeldingsmappen met de Z-serie beelden van de twee biofilmcomponenten. Kies vervolgens de twee kanalen die gecorreleerd en geanalyseerd zullen worden.

De twee beeldstacks moeten identieke pixelafmetingen hebben in alle dimensies en hetzelfde aantal beelden per stack bevatten. Stel de drempelwaarden voor elk kanaal in, volg de instructies in de software-interface en voer de gegevens in het gegevensverwerkingsbestand in voor analyse. Deze figuur laat zien hoe duo stack de ruimtelijke relatie tussen bacteriën en DBS kwantitatief interpreteert.

Binnen de biofilm berekent Duo stack de verticale distributie van bacteriën en DPS van het schijfoppervlak tot de vloeistoffase, zoals hier te zien is aan de groene lijn voor bacteriën en de rode lijn voor EPS. Het berekent ook de colocalisatie van bacteriën en DPS over de dikte van de biofilm. Zoals getoond in de gele lijn, vertonen de gegevens hogere proporties EPS dan bacteriën over de biofilmdiepte, en de meeste bacteriële cellen zijn geassocieerd met EPS, vooral vanaf de middelste lagen en hoger. Duo stat met 3D-rendering biedt een verbeterd begrip van de structurele organisatie en interactie van bacteriën en DPS in biofilms.

Om ervoor te zorgen dat er RNA van hoge kwaliteit uit biofilms wordt verkregen, raden wij aan om de RNA-extractie uit te voeren volgens het biofilmspecifieke protocol dat is beschreven in het artikel van Curian KU, gepubliceerd in 2007. In het tijdschrift Analytical Biochemistry worden standaardprotocollen gebruikt voor de preparatie van cDNA-microarrays en kwantitatieve realtime PCR-assays. Om de analyse van de grote datasets die door microarray-experimenten worden gegenereerd te vergemakkelijken, hebben we software voor datamining en organisatie ontworpen, de microarray data visualizer of MDV, die online beschikbaar is via www.oralgen.anl.gov.

Voordat de gegevens naar MDV worden verzonden, dient een statistische analyse te worden uitgevoerd, zoals een gepaarde T-test met een random variance-model, met behulp van de online beschikbare BRB array tool-software, waarbij een afkapwaarde (P-waarde) van 0,001 wordt gehanteerd voor de klassenvergelijking. In dit voorbeeld is een analyse uitgevoerd op s mutton's, biofilms gekweekt in drie verschillende sugerconcentraties en op vier tijdstippen. Er werden gepaarde vergelijkingen uitgevoerd die resulteerden in drie BRB-bestanden: conditie A 0,5% sucrose plus 1% zetmeel versus 1% sucrose, conditie B 0,5% sucrose plus 1% zetmeel versus 0,5% sucrose en conditie C 0,5% sucrose versus 1% sucrose.

Dit paneel geeft het aantal genen weer dat als differentieel tot expressie gebracht is gedetecteerd in elke conditie en op elk tijdstip, geëvalueerd via standaard klassevergelijking met de BRB array tool, wat resulteert in een groot aantal genen aangeduid als BRB ruwe data. Voor de demonstratie van MDV zullen we ons met behulp van Excel richten op tijdstip 30 uur. Converteer de BRB ruwe data naar MDV tab-begrensde tekstbestanden.

Zorg ervoor dat alle letters die bij het nummer van het genlocus-tabblad horen worden verwijderd, bijvoorbeeld in de naam SMU dot 1432 C. Verwijder de letter C en open MDV. Open het bestandmenu en kies voor het selecteren van de annotatiebron. Selecteer de optie flat file wanneer er een dialoogvenster verschijnt.

Gebruik de browse-knoppen om de bestanden te selecteren die annotaties bevatten voor gene ontology-nummer, pathway-functionele classificatiedata en gennaam. Ga naar 'file' en importeer elk van de bestanden die zijn geconverteerd naar het MDV-formaat. Elk bestand vertegenwoordigt een experimentele conditie.

Vergelijk de genen die tot expressie komen in elke experimentele conditie A versus B versus C. In dit voorbeeld gebruiken we de functie van het Venn-diagram. Voor deze demonstratie richten we ons op differentieel tot expressie gekomen genen die uniek gerelateerd zijn aan de invloeden van sucrose en zetmeel in combinatie. De functie op basis van het Venn-diagram wordt gebruikt om het aantal unieke en gedeelde genen te visualiseren die onder deze verschillende condities tot expressie komen, en helpt ons bij het identificeren van de genen die geselecteerd moeten worden voor verdere analyse.

Hier selecteren we alleen de differentieel tot expressie gebrachte genen die uniek zijn in conditie A en/of B, maar niet die welke in C zijn gedetecteerd, zoals hier in het grijs wordt weergegeven. MDV heeft het totale aantal te analyseren genen aanzienlijk verminderd en tegelijkertijd de niet-relevante genen voor de experimentele casus gefilterd. Kies via het bestandmenu de exportoptie om de gegevens op te slaan.

Als tab-gescheiden bestanden kunnen de bestanden vervolgens worden geopend in Excel, waar de data-output kan worden georganiseerd en kan worden omgezet in de gewenste grafische weergaven. De dataorganisatie in Excel maakt de grafische weergave van de MDV-output mogelijk. Deze grafiek geeft een overzicht van de differentiële expressie van unieke functionele subsets van genen die worden beïnvloed door de combinatie van zetmeel en sucrose in verschillende stadia van biofilmontwikkeling.

De invloeden op het transcriptoom van de S-mutanten zijn na 30 uur van biofilmvorming uitgesprokener dan op andere tijdstippen. De resultaten hielpen ons om precies specifieke functionele subsets van genen te identificeren die relevant zijn voor onze werkhypothese, waarbij de temporele effecten de genselectie en het verdere validatieproces hebben gefaciliteerd. Na deze procedure kunnen ook biochemische en proteomische methoden worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals wat de specifieke fysiologische en metabole responsen van de organismen binnen biofilmen zijn.

Een dergelijke uitgebreide en geïntegreerde analyse zou zeker helpen om beter te begrijpen hoe biofilms de pathogeniteit in de mondholte moduleren, een zeer dynamische en complexe omgeving. Raadpleeg voor meer details het PDF-bestand dat bij dit video-artikel is gevoegd.