Verbeterde visualisatie en kwantitatieve analyse van de Drug effecten met behulp van micropatterned cellen

Het algemene doel van de volgende procedure is om aan te tonen hoe de normalisatie van de celarchitectuur en -positie, bereikt op specifieke adhesieve micropatronen, een eenvoudige automatisering van beeldacquisitie en een ongecompliceerde beeldbewerking mogelijk maakt met een gevoelige en robuuste kwantificering van drugseffecten, wat niet haalbaar is op conventionele glazen dekglassteunen. Dit wordt bereikt door heli-cellen uit te zaaien op SI two chips die L-vormige SI three gelabelde micropatronen bevatten. De cellen nemen een driehoekige vorm aan waarbij een belangrijke stressfiber wordt gevormd die de twee uiteinden van de L overspant. De patrooncellen worden vervolgens geïncubeerd met lebos statine of onbehandeld gelaten, waarna ze gefixeerd en gekleurd worden om het actine-cytoskelet en de kernen te visualiseren.

Afbeeldingen van de micropatrooncellen worden vervolgens vastgelegd en verwerkt met behulp van de cell ref-macro om een stapel afbeeldingen voor analyse te genereren, en de hypotenuse-macro om fenotypes te kwantificeren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een significant effect van lage doses BLEs statine op micropatroon HELOC-cellen laten zien, wat niet detecteerbaar is onder standaard kweekcondities. Hallo, welkom.

We zijn hier vandaag om u door ons experimentele protocol te leiden waarin wordt uitgelegd hoe adhesieve micropatronen kunnen worden gebruikt voor celanalyse, en om u experimentele gegevens te tonen die de eenvoudige kwantificering van zeer lage doses geneesmiddelen op deze adhesieve micropatronen illustreren. Wanneer u deze micropatronen voor het eerst ziet, zult u direct begrijpen hoe ze variabiliteitsproblemen bij het vastleggen van beelden tijdens celanalyse kunnen oplossen. Door namelijk een reeks cellen te hebben, vergelijkbaar met een microarray, kunt u de microscooptafel eenvoudig van cel naar cel bewegen om beelden stapsgewijs vast te leggen.

Maar dat is natuurlijk niet het enige voordeel dat micropatronen bieden. Ze zorgen voor veel meer verbeteringen, omdat we met bepaalde typische micropatronen, zoals het kruis of de Y, de interne celarchitectuur normaliseren. Dit betekent dat organellen, de mitotische spoel, het cytoskelet en verschillende eiwitnetwerken in elke cel op dezelfde locatie of in dezelfde oriëntatie bevinden, waardoor het veel eenvoudiger is om de effecten van geneesmiddelen op deze specifieke patronen te voorspellen en te kwantificeren. Dit mag wellicht contra-intuïtief overkomen vergeleken met wat gewoonlijk in een klassieke Petrischaal of microplate wordt gedaan.

Nou, omdat u natuurlijk vaak ziet dat cellen rondbewegen en verschillende morfologieën aannemen. Terwijl op de adhesieve micropatronen alle cellen er hetzelfde uit zullen gaan zien, omdat ze reageren op dit adhesieve micropatroon en hun architectuur op dezelfde manier organiseren. Dit lijkt wellicht zelfs een beetje kunstmatig, maar als u er goed naar kijkt, is de Petrischaal dan niet nog kunstmatiger?

Omdat cellen in weefsels worden beperkt door zowel de naburige cellen als door de extracellulaire matrix. Hierdoor ontvangen ze veel ruimtelijke informatie, die de celarchitectuur oriënteert. En dit is precies wat we doen met micropatronen.

We herstellen deze ruimtelijke informatie in de cellen; alle cellen reageren hierop en organiseren zich op dezelfde manier. Omdat de cellen nu allemaal op elkaar lijken, kunnen we het concept van de referentiecel introduceren. Dit houdt in dat we alle beelden kunnen middelen om één enkel beeld te verkrijgen dat echt representatief is voor hoe de cel eruitziet onder een bepaalde conditie. Vervolgens kan er een medicijn worden toegevoegd om opnieuw naar die referentiecel te kijken en te zien hoe de morfologie of de organisatie van de cel is gewijzigd als reactie op dat medicijn.

Plaats twee situ two chips afzonderlijk in twee onafhankelijke putjes van een six-well plaat, waarbij u erop let dat het situ two-logo leesbaar is. De situ two chips die voor dit experiment worden gebruikt, hebben micropatronen die zijn gekleurd met FibroGen SI three en moeten voor gebruik in het donker worden bewaard. Oogst hela-cellen die ongeveer 80% confluent zijn met trypsine en controleer onder een microscoop of ze correct zijn geïndividualiseerd. Centrifugeer gedurende vier minuten bij 300 G en resuspendeer de cellen voorzichtig. Tel en verdun de cellen tot een concentratie van 15.000 cellen per milliliter.

Breng 60.000 cellen per well aan in incomple D-M-E-M-F 12 kweekmedia. De plaat moet zo min mogelijk worden bewogen om te voorkomen dat er draaibewegingen in het medium ontstaan, waardoor de cellen zich in het centrum zouden concentreren. Laat de cellen 10 minuten sedimenteren onder de laminaire flowkast en plaats ze vervolgens in de celincubator.

Binnen 10 tot 20 minuten in de celincubator zullen de cellen beginnen te adhereren na 10 minuten; controleer regelmatig onder de microscoop of de cellen zijn gehecht. Vervang het celmedium en verwijder overtollige cellen door de volgende procedure vier keer te herhalen. Houd de plaat vlak en aspireer voorzichtig het medium vanaf de zijkant van de well.

Zorg ervoor dat er voldoende medium aanwezig blijft om te voorkomen dat de chip uitdroogt. Voeg vier milliliter PBS toe en aspireer beginnend vanuit het centrum van de chip. Verplaats vervolgens de pipet naar de zijkant van de put om, zoals eerder gedaan, het grootste deel van de PBS te aspireren en controleer onder de microscoop op zwevende cellen.

Indien er een grote hoeveelheid drijvende cellen overblijft, dient de wasprocedure te worden herhaald. Als er zeer weinig cellen aanwezig zijn, wordt een deel van de PBS afgezogen en vervangen door twee milliliters vers medium; voer deze handeling tweemaal uit door telkens vier milliliters vers medium toe te voegen. Incubeer de cellen gedurende drie uur in een celincubator om de cellen volledig te laten uitspreiden.

Met deze methode zal tussen de 10 en 30% van de micropatronen bezet zijn door één enkele cel, terwijl andere patronen leeg zullen zijn of bezet door meerdere cellen. Om de cellen te behandelen met BLEs-statine, dient de 17 millimolaire stockoplossing van het geneesmiddel te worden verdund tot een uiteindelijke concentratie van vijf micromolar met 0,1% DMSO in vier milliliter medium. Bereid voor de controle medium voor met enkel 0,1% DMSO; aspireer het celmedium en vervang dit snel door de BLEs-statine- of de controlesoluties om te voorkomen dat de chip uitdroogt.

Incubeer de cellen gedurende één uur bij 37 °C. Bereid tijdens deze incubatie de cytoskeletbuffer. Voeg één gram sucrose toe aan twee milliliters cb.

Dit helpt om de interne celstructuren te behouden. Meng één milliliter CB-sucrose met vier milliliter 5% PFA. Voeg twee milliliter PFA in CB-sucrose-oplossing toe.

In twee putjes van een nieuwe zesputjesplaat. Gebruik een pincet om de CY two chip op te pakken en plaats deze in de zesputjesplaat die twee milliliter PFA in CB-sucrose-oplossing bevat om de cellen te fixeren. Incubeer de cellen 10 minuten bij kamertemperatuur, verwijder de PFA en was de cellen eenmaal met PBS, waarna de cellen 10 minuten gewassen worden met twee milliliter 100 millimolair ammoniumchloride.

Om de resterende cross-linking activiteit van PFA te stoppen, worden de cellen permeabiliseert door twee milliliter PBS met 0,1% tritton X 100 gedurende drie minuten toe te voegen, waarna ze tweemaal worden gewassen met PBS. Kleur de actinefilamenten met twee milliliter ZI-geconjugeerd phaloïne in een verdunning van 1:2000 in PBS met 1,5% BSA en incubeer dit gedurende één uur bij kamertemperatuur. Was de cellen vervolgens één keer met twee milliliter PBS. Kleur daarna de celkernen.

Voeg twee milliliters van één milligram per milliliter hawked in PBS toe en incubeer drie minuten bij kamertemperatuur. Was twee keer met twee milliliters PBS. Monteer de side two chips op een standaard objectglas met behulp van 25 tot 30 microliters monteersolution, zoals al.

Om beelden in drie golflengten te verkrijgen, maken we gebruik van Metamorph-beeldverwerkingssoftware en een NIK icon eclipse T-microscoop, uitgerust met een CCD Hema Matsu-camera en een intens lite kwikvezelverlichtingsbron. Selecteer eerst een vergroting van 20 x.

Open vervolgens in de menubalk multidimensionale acquisitie om de verschillende parameters van het experiment in te stellen. Geef eerst aan waar de gegevens moeten worden opgeslagen.

Stel het aantal golflengten in op drie, selecteer de SI-drie-golflengte en positioneer het dekglas zodanig dat 12 micropatronen gecentreerd zijn in het gezichtsveld van de camera. Het aantal gevisualiseerde micropatronen per veld zal variëren afhankelijk van de configuraties van de camera en het objectief. Stel de belichtingstijd voor elke golflengte in en voer de autofocus uit.

Maak voor PS drie een journaal voor multidimensionale acquisitie aan en sla dit op als MDA jnl. Open de scanstage-functie om 24 afbeeldingen te verkrijgen, die elk 12 micropatronen bevatten. Voer zes kolommen en vier rijen in met een x-stapgrootte van -400 micron en een y-stapgrootte van 300 micron in het journaal om deze uit te voeren; upload het journaal MDA jnl en druk op 'scan' om de geautomatiseerde acquisitie van de 24 afbeeldingen in de drie golflengten te starten.

In deze video worden L-micropatronen gebruikt om de vorming van één enkele grote actine-stressfiber te stimuleren die het niet-gehechte deel van de cel ondersteunt, waardoor de visualisatie en meting van de impact van BLE-statine op cellen wordt vereenvoudigd in vergelijking met cellen op vlakke fibronectine. Voor geautomatiseerde beeldbewerking en analyse beschrijven we twee op maat gemaakte macro's, geschreven voor het opensource-programma ImageJ; vanuit een stapel ruwe beelden extraheert de eerste macro individuele cellen en creëert een referentiecel. De tweede macro meet de collaps van het celmembraan.

De eerste stap is de segmentatie van individuele cellen uit ruwe beelden. De fluorescentiegelabelde beelden van micro patronen worden gebruikt om regio's af te bakenen die gecentreerd zijn op de micro patronen; deze worden uit de beelden van elke golflengte geknipt en opnieuw samengevoegd tot stacks voor elke golflengte. Om micro patronen met enkelvoudige cellen te selecteren, detecteert de macro het aantal kernen per beeld en verwijdert in alle stacks die beelden die ofwel meer dan één kern of geen kernen bevatten.

Ten slotte wordt de ImageJ-plugin multi-stack reg gebruikt om alle verzamelde beelden en alle kanalen opnieuw uit te lijnen op basis van de positie van het micropatroon. Deze stap genereert line stacks van individuele beelden die nu kunnen worden gebruikt voor enkelcelanalyse of voor het maken van een referentiecel. In ImageJ wordt de referentiecel geconstrueerd door een projectie te maken van de gefilterde en uitgelijnde beelden uit een stack.

Verschillende projectiemethoden kunnen worden toegepast, maar gewoonlijk wordt een mediaanprojectie gekozen om uitschieters in de beeldstack te elimineren. De referentiecel is een uniek en nuttig hulpmiddel voor representatie en beeldanalyse dat alleen met micropattern-cellen kan worden verkregen. Om de analyse te vergemakkelijken, wordt een opzoektabel of LUT toegepast om het monokleurendbeeld om te zetten in een gecodeerde frequentiekaart.

Om het effect van statines op de BLE's te karakteriseren, werden de stijfheid en het inklappen van de cel geanalyseerd met behulp van een tweede Image J-macro. Kort gezegd worden drempelwaardebeelden (threshold images) van het L-micropatroon gebruikt om een theoretische hypotenusa van de driehoekige celvorm te definiëren. Vervolgens wordt een drempelwaardeanalyse van de beelden met actinekleuring uitgevoerd om de celvorm te bepalen.

Het verschil in oppervlakte tussen de theoretische hypotenusa en het werkelijke concave celmembraan wordt vervolgens gemeten; cellen die een oppervlakte onder de theoretische hypotenusa vertonen, worden als ingestort beschouwd. De impact van vijf micromolaire BLEs statine werd gekenmerkt door het aantal ingestorte cellen in behandelde en controlecondities te vergelijken. Typische beelden van L micropattern-cellen behandeld met BLEs statine of onbehandeld zijn getoond; de cellen waren gefixeerd en gekleurd in micropatterns.

Actine en celkernen zijn respectievelijk in rood, groen en blauw weergegeven. Let op het effect van BLEs statine op de celvorm in vergelijking met de controlecondities. Hier worden representatieve cellen getoond na incubatie met BLEs statine of controles op onbehandelde fibronectine.

De cellen zijn gefixeerd en gekleurd; actine en kernen zijn respectievelijk in het groen en blauw weergegeven. Let op de gelijkenis tussen de behandelde en de gecontroleerde condities. Er worden typische beelden getoond van referentiecellen verkregen uit cellen die zijn behandeld met BLEs statine of onbehandeld zijn gelaten.

Let op het potentieel van deze benadering voor eenvoudige observatie van het bestudeerde fenotype. Hier is een voorbeeld van een analyse van de effecten van BLEs statine op cellen met behulp van de macro-hypotenusa. Terwijl 25% van de controlecellen was ingeklapt, nam dit drievoudig toe tot 75% in de cellen die behandeld waren met vijf micromolar BLEs statine, wat wijst op het verzwakte actinine contractiele netwerk.

Na het bekijken hiervan zou u nu een goed begrip moeten hebben van hoe adhesieve micropatronen verschillende knelpunten in high-content analyse oplossen. Ten eerste heeft het gebruik van adhesieve micropatronen de analyse van de beeldvastleggingsverwerking veel eenvoudiger gemaakt. Ten tweede maken micropatronen de detectie van zeer subtiele effecten van geneesmiddelen bij zeer lage doses mogelijk, omdat u de variabiliteit tussen cellen vermindert door hun morfologie en hun gedrag te normaliseren.

En tot slot: in vergelijking met de duizenden cellen die gewoonlijk nodig zijn om een goed resultaat te behalen bij celanalyse, heeft u met onze referentiecel slechts enkele tientallen cellen nodig om een robuust en significant resultaat te verkrijgen.