Het verzamelen van variabele concentratie Isothermische Titration Calorimetrie Datasets om Binding mechanismen bepalen

Het algemene doel van deze procedure is het identificeren van het juiste fysieke model dat de binding van een macromolecuul aan zijn ligand beschrijft en het bepalen van de bijbehorende thermodynamische parameters. Dit wordt bereikt door eerst een voorraadoplossing van het macromolecuul voor te bereiden via uitgebreide dialyse. De betreffende ligand wordt vervolgens opgelost in de uiteindelijke dialysebuffer en in de tweede stap worden de concentraties van alle componenten bepaald.

De macromolecuul- en ligandmonsters worden zorgvuldig verdund tot een reeks verschillende concentraties. Vervolgens wordt een reeks isotherme titratiecalorimetrie-experimenten, of ITC-experimenten, uitgevoerd bij verschillende concentraties van zowel het ligand als het eiwit om in de laatste stap van de procedure een reeks ITC-isothermen te genereren. Er wordt een globale analyse van de reeks experimenten uitgevoerd met behulp van verschillende fysische modellen, waarbij het model dat de beste totale overeenstemming vertoont als correct wordt geïdentificeerd.

Vandaag laat ik u een methode zien die kan helpen bij het beantwoorden van biofysische vragen, zoals de wijze waarop eiwitmoleculen hun liganden binden, en die nauwkeurige metingen kan leveren van bindingsparameters zoals entropie, enthalpie en associatieconstanten. Zuiver vóór de start van dit protocol het betreffende eiwit; het macromolecule dat in deze demonstratie wordt gebruikt is een immuno GLYCOSIDE N six prime, een subtiel transferase one I of een C six prime one I. Begin met het bereiden van vier liter dialysebuffer en koel dit af tot vier graden Celsius. Dialyse vervolgens een klein volume van een macromolecule-oplossing.

In dit geval worden vijf milliliter 400 micromolaire AAC C zes prime, één eye in 1,3 liter dialysebuffer bij vier graden Celsius gebracht. Dit kan in een koudekamer of een koelkast worden gedaan; vervang de buffer elke acht uur en dialyseer in totaal drie keer. Bewaar de uiteindelijke dialyseoplossing.

Filter 750 milliliters van de uiteindelijke dialysevloeistof door een 0,45 micron cellulosefilter en bewaar deze bij vier graden Celsius. Deze buffer, nu aangeduid als de loopbuffer, zal worden gebruikt voor spoelingen en als verdunningsmiddel. Spoel voor de monsters een 0,2 micron spuitfilter grondig door met de loopbuffer.

Breng het eiwitmonster aan en filter dit. Verzamel het monster voorzichtig in een conische buis voordat de eiwitoplossing wordt bewaard, en bepaal de eiwitconcentratie met een standaard eiwitassay. In dit geval wordt de eiwitconcentratie gemeten via ABSORPTIE bij 280 nanometer en wordt de enzymconcentratie berekend.

Gebruik een extinctiecoëfficiënt die is gegenereerd met de EXI-proteomicserver en bewaar het eiwit op een manier die de langetermijnstabiliteit maximaliseert. AAC C six prime one eye moet worden bewaard bij 4 °C, aangezien het geen activiteit behoudt na invriezen en ontdooien. Los vervolgens de ligand en de runbuffer op. Voor deze demonstratie werden 4 mg acetyl-co-enzym A opgelost in 200 µL runbuffer om een stockoplossing van 25 mM te maken.

Dit ligand kan worden bewaard bij -78 °C tot het klaar is voor gebruik om de ITC-monsters voor te bereiden. Bereken eerst de enzymconcentratie om een C-waarde van 64 te verkrijgen, zoals beschreven in het schriftelijke protocol voor AAC 6'1. Dit komt overeen met een concentratie van 192 µM. Bereid een oplossing van 2 mL van het macromolecuul bij deze concentratie door de stamoplossing te verdunnen met de gefilterde running buffer. Laat de acetal-co-enzym A-oplossing ontdooien in een ijswaterbad. Zodra de acetal-co-enzym A-oplossing is ontdooid, moet deze voorzichtig worden gemengd. Bereken de concentratie van de ligandoplossing door de macromolecuulconcentratie te vermenigvuldigen met het aantal bindingsplaatsen en vervolgens met 10.

Bereid de acetyl-co-enzym A-oplossing door 80 µL van de 25 mM acetyl-co-enzym A-stamsoplossing toe te voegen aan 420 µL loopbuffer en te mengen. Overbreng de verdunde acetyl-co-enzym A-oplossing naar een vulbuis voor de pipet en bewaar de resterende 25 mM stamsoplossing bij -78 °C. Ontgas de AC6'1I- en acetyl-co-enzym A-oplossingen gedurende vijf minuten onder vacuüm bij 19 °C, wat één graad Celsius onder de gewenste experimentele looptemperatuur ligt.

Om de injectiespuit klaar te maken, schuift u de spuit door een spuithouder totdat de vooraf gemonteerde spuitklem zich op dezelfde hoogte als de houder bevindt. Plaats de tweede spuitklem over de injectiespuit totdat deze stevig tegen de onderkant van de spuithouder is gedrukt. Draai de klem voorzichtig vast met de meegeleverde 0,05 inch kogelkop-inbussleutel.

Plaats vervolgens de spuitenhouder in de pipethouder. Schuif de pipetinjector voorzichtig in de injectiespuit en zorg ervoor dat de punt van de zuiger direct in de opening van de spuit wordt gevoerd. Draai, zodra deze volledig is ingebracht, de borgring van de spuitenhouder in de pipetinjector.

Voordat de eiwitmonsteroplossing van A a C six prime one eye wordt geladen, dient de monstercel te worden gewassen met ten minste 50 milliliters running buffer met behulp van het bij het instrument geleverde celwas-systeem. Verwijder de resterende buffer uit de monstercel door aspiratie met een glazen spuit van 2,5 milliliter met een lange naald. Verwijder de oplossingen uit het ontgassingsvacuüm met een tweede schone, droge lange naald.

Spuit van 2,5 milliliter. Trek voorzichtig minimaal 1,8 milliliter van het A a C six prime one eye protein-monster op in de spuit. Voorkom zorgvuldig de vorming van luchtbellen.

Zodra de spuit is gevuld met het eiwitmonster, steekt u de naald in de monstercel en raakt u voorzichtig de bodem van de cel aan. Til de naald ongeveer één millimeter op en injecteer het monster voorzichtig in de cel totdat er bovenaan de monstercel overtollige vloeistof zichtbaar is. Om eventuele ingesloten luchtbellen uit de cel te spoelen, tilt u de naald ongeveer één centimeter op terwijl u ervoor zorgt dat er vloeistof in de overloop blijft, waarna u snel ongeveer 0,25 milliliters van de oplossing opzuigt en weer injecteert.

Schuif de naald nu voorzichtig omhoog langs de zijkant van de overloop. In de monsterput zal de naald tegen een rand stoten. Trek alle vloeistof boven deze rand weg, aangezien de rand de gewenste hoogte voor de loopoplossing aangeeft.

Om de injectiespuit te vullen, bevestigt u de plastic slang van de vullingspuit aan de vulpoort en brengt u de punt van de zuiger naar de bovenkant van de vulpoort. Plaats nu de vulbuis van de pipet met de DGA-ligandoplossing onderin de pipethouder. Controleer of de punt van de spuit de bodem van de vulbuis niet raakt en trek de oplossing langzaam in de spuit totdat er een kleine hoeveelheid in de slang van de vullingspuit stroomt.

Sluit vervolgens de vulpoort door de plunjerpunt te laten zakken. Dit gebeurt door op de knop 'vulpoort sluiten' te klikken. Verwijder daarna eventuele luchtbellen die tijdens het laden bekneld kunnen zijn geraakt.

Spoor de vloeistof af en vul opnieuw door op de knop 'purge refill' te klikken. Voer dit proces in totaal drie keer uit. Zodra het spoel- en vulproces is voltooid, verwijdert u de vulbuis uit de pipethouder en veegt u de tip van de spuit voorzichtig af met laboratoriumpapier.

Laat nu de spuit van de pipetbehuizing in het monster zakken. Wees voorzichtig en ga langzaam te werk, aangezien de naald gemakkelijk kan buigen. Zorg ervoor dat de spuit volledig is ingevoerd door op de basis van de vergrendelingskraag te drukken.

Zodra de spuit is vastgezet, stelt u de gewenste bedrijfstemperatuur in en selecteert u een referentievermogen dat iets hoger is dan de maximaal verwachte warmtestroom bij injectie. In dit voorbeeld worden 20 °C en 20 µcal/s respectievelijk gebruikt als bedrijfstemperatuur en referentievermogen. Programmeer vervolgens de gewenste injectievolumes en vertragingen.

Hier worden 28 injecties gebruikt, waarbij de eerste een volume van 2 µL heeft met een vertraging van 62 s, en de daaropvolgende injecties een volume van 10 µL hebben met vertragingen van 332 s. Het hier gedemonstreerde experiment vormt de basis voor het genereren van een dataset bij een enkele concentratie om de nodige aanvullende curves te genereren. Herhaal dit proces met afnemende macromolecuul- en ligandconcentraties.

Zorg ervoor dat alle macromolecuul- en ligandmonsters afkomstig zijn van dezelfde voorraadoplossing om fouten in de concentraties te minimaliseren. Hier wordt de ruwe isotherme titratiecalorimetrie-curve getoond die is verkregen uit de titratie van 3,86 millimolair ligand acetyl-co-enzym A in 192 micromolair van het micromolecuul A A C zes prime één.

Geïntegreerde waarden van de oogmetingen werden gebruikt om de bindingsparameters te bepalen met een sequentiële fit voor twee bindingsplaatsen. Deze grafiek toont de isothermen gegenereerd door ITC van variërende concentraties ACE Coenzyme A en AAC C six Prime One Eye. De experimentele gegevens, weergegeven door open cirkels, werden gefit aan zowel een model met twee onafhankelijke sets bindingsplaatsen als aan een sequentieel model met twee bindingsplaatsen.

Een betere overeenstemming is waarneembaar bij het sequentiële model met twee bindingsplaatsen. De gebruikte proteïneconcentraties zijn gedefinieerd in de bijbehorende tekst. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om zeer nauwkeurig te zijn met de verdunning, aangezien wijzigingen in de concentraties een drastische impact op de resultaten kunnen hebben.