Methoden voor snelle overdracht en localisatie van Lyme pathogenen in de Tick Gut
14 februari 2011
De ziekte van Lyme studies vereisen vaak generatie van de teken besmet met de ziekteverwekker Borrelia burgdorferi, een proces dat normaal gesproken duurt enkele weken. Hier laten we zien een micro-injectie-based tick infectie procedure die kan worden bereikt binnen enkele uren. We tonen ook aan een immunofluorescentie methode voor het in situ lokalisatie van B. burgdorferi in teken.
Het algemene doel van deze procedure is om Borrelia burgdorferi-cellen via micro-injectie te lokaliseren in de darm van de teek. Dit wordt bereikt door eerst de glazen capillaire naalden voor te bereiden en deze te vullen met B. burgdorferi-cellen. Vervolgens worden de B. burgdorferi-cellen via micro-injectie overgebracht naar de darm van de teek.
De teek wordt vervolgens gedisseceerd en de darmweefsels worden verwijderd. Ten slotte wordt immunofluorescentielabeling van beberg defer in de teekdarm uitgevoerd. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de lokalisatie van beberg to ferry in de teekdarm aantonen met behulp van confocale microscopie.
Hallo, ik ben dr. Ruth Paul Paul, universitair docent aan de University of Maryland bij de afdeling Veterinaire Geneeskunde. Vandaag zullen twee leden van mijn laboratorium, Toro Cairo, een postdoctoral fellow, en Adam Coleman, een promovendus, u de procedure laten zien voor de kunstmatige infectie van teken via microinjectie die wij routinematig in het laboratorium uitvoeren. Na de microinjectie zullen we de teek dissekeren en de bacteriën in de darm van de teek in beeld brengen met een confocale CE-microscoop.
Het belangrijkste voordeel van micro-injectie bij een generatie natuurlijk geïnfecteerde teken is de duur van de procedure. Micro-injectie verkort de gehele procedure van weken naar uren, aangezien er ongeveer vijf weken nodig zijn om geïnfecteerde tekenen te verkrijgen via het natuurlijke voedingsproces. Deze techniek kan ook worden aangepast om andere nuttige reagentia te injecteren, zoals dubbelstrengs RNA voor RNAi of antisera voor specifieke antilichaaminterferentie in de teek.
Begin met het vervaardigen van verschillende microinjectienaalden door glazen capillaire buisjes van één millimeter te verhitten en uit te trekken in een glazen micropipet-trekapparaat. Verwijder de fragiele capillaire buisjes voorzichtig. Bewaar de verzamelde naalden met de punt naar boven gericht op plakband in een Petrischaal.
Kweek vervolgens b berg de ferry in BSK-medium tot een concentratie van ongeveer 10⁷ cellen per milliliter. Pelleteer b berg de ferry door centrifugatie bij 3000 ×g gedurende 10 minuten. Verwijder bij kamertemperatuur het supernatant en resuspendeer het pellet volledig in BSK-medium door het voorzichtig door een steriele microtip van 200 µL te pipetteren tot een uiteindelijke concentratie van 10⁹ cellen per milliliter.
Aangezien de cellen worden geresuspendeerd bij een hoge celdichtheid en kunnen samenklonteren, moet de celsuspensie onmiddellijk worden gebruikt voor micro-injectie. Om de teken voor te bereiden, wordt transparante dubbelzijdige plakband op een glazen objectglas geplaatst op een plakmat. Verwijder de teken voorzichtig uit de houder. Plaats met een klein penseel het benodigde aantal te injecteren teken op de plakband, met de ventrale zijde naar boven en in dezelfde richting gericht. Laad vijf microliters van de beberg de ferry culture in de gepoolde capillaire naald. Controleer de naald op ingesloten luchtbellen met een micro-load pipetpunt van 20 microliter en laad de naald opnieuw met de bacteriële cultuur.
Bekijk indien nodig de teek onder de dissectie-binoculaire microscoop en focus op het gebied rond de anale opening van de teek. Raak voorzichtig de punt van de capillaire naald aan om de buis te breken op het punt waar de diameter iets kleiner is dan die van de anale opening van de teek, zodat de micro-injectienaald wordt gevormd. Deze stap is cruciaal, aangezien elke poging om teken te injecteren met ongeschikte naaldpunten letsel en mogelijk de dood van het dier veroorzaakt.
Bij de geïnjecteerde teek. Plaats de geïmmobiliseerde teken onder de dissectie-binoculaire microscoop en focus op de anale opening, die bedekt is door twee beweegbare anale platen. Raak met een fijne pincet voorzichtig elk gebied nabij de anale opening aan en oefen zeer lichte druk uit.
Dit maakt het mogelijk om de anale platen te scheiden en de anale porie die verbonden is met het darmkanaal te openen. Steek de naaldpunt voorzichtig een klein stukje in de anale opening door de geforceerde opening van de anale platen. De insertie van de naald moet tot een minimum worden beperkt, aangezien de glazen punt de halftransparante achterdarm die met het rectum is verbonden, kan beschadigen.
Gebruik een micro-injector die is uitgerust met een automatische voetbediening om de ferry-oplossing te injecteren met de volgende parameters: 1000 Hector Pascal injectiedruk, 0,2 seconden injectietijd en acht Hector Pascal compensatiedruk. Elk embryo ontvangt na de micro-injectie een enkele injectie.
De teek moet tekenen van beweging vertonen of kruipen als reactie op stimuli, vergelijkbaar met de situatie vóór de injectie. Om tekenen te dissekeren voor immunofluorescentiemicroscopie, plaatst u eerst een druppel fosfaatgebufferde zoutoplossing op een schoon glazen objectglas voor dissectie en een andere druppel op een met poly-L-lysine gecoat objectglas. Bereid voor de microscopie een ander glazen objectglas voor met dubbelzijdige plakband. Verwijder vervolgens de teek uit de container en plaats deze op de dubbelzijdige plakband.
Gebruik een klein penseeltje onder de dissectiemicroscoop, focus op de teek en plaats een scherp scheermesje op de teek tussen het eerste en tweede paar poten. Druk stevig naar beneden om de teek in twee stukken te snijden, zodat het abdomen bloot komt te liggen; dompel het abdomen onmiddellijk onder in een druppel PBS met behulp van een fijne pincet. Pak het dorsale en ventrale exoskelet vast rond de snijplaats.
Trek het rugschild voorzichtig omhoog en weg van de teek, zodat de bruingekleurde darmdivertikels zichtbaar worden. Zorg ervoor dat de teken die worden gedisseceerd te allen tijde onder het PBS blijven. De semi-translucente speekselklierbundels bevinden zich aan weerszijden van de anterieure regio van de darm en kunnen op dit punt worden verwijderd indien gewenst.
Houd het resterende exoskelet met een pincet op zijn plaats en trek de darm voorzichtig uit het abdomen. Reinig de darm zorgvuldig door eventueel ingesloten weefsels, zoals de trachea, te verwijderen. Breng de darm van de teek met de punt van een fijne pincet snel over naar een druppel PBS op een met poly-L-lysine gecoate glazen objectglas.
Verdeel de darm in kleinere stukjes met behulp van fijne mesjes of door voorzichtig te drukken met de punt van een fijne pincet. Aspireer zorgvuldig het overtollige PBS rondom de darmweefsels. Laat de darmweefsels aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.
Fixeer de darm van de teek door deze gedurende 10 minuten onder te dompelen in aceton. Laat de darm aan de lucht drogen bij kamertemperatuur; preparaten kunnen in deze stap gedurende maanden worden bewaard bij -20 °C in een luchtdichte container. Trek voor immunofluorescente kleuring van de darm met een pap-pen of een ander hydrofoob barrièremiddel een cirkel rond de gefixeerde teekdarm.
Dit helpt om de kleuringsoplossingen vast te houden tijdens de daaropvolgende incubatiestappen. Bedek de darm van de teek met één of enkele druppels blokkeringsbuffer gedurende 30 minuten. Bij kamertemperatuur.
Het serum dat wordt gebruikt voor het blokkeren is afhankelijk van de gastheer van het antilichaam. Zorg ervoor dat het objectglas vanaf dit punt niet uitdroogt. Aspireer de blokkeringsbuffer langzaam.
Incubeer de darm met geschikte primaire en/of secundaire antilichaamoplossingen. Wij gebruiken fluoresceïne-isothiocyanaat- of FITC-gelabelde anti-B. berg. Voeg het antilichaam toe in een verdunning van 1:100 in blokkeringsbuffer gedurende één uur.
Bedek de container bij kamertemperatuur met aluminiumfolie om blootstelling aan licht te beperken. Verwijder de antilichaamoplossing door voorzichtig op te zuigen. Incubeer het darmkanaal met een fluorescerende kleurstof om teekweefsels te labelen, zoals DPI of propidiumjodide.
Normaal gesproken gebruiken we 20 µg/mL propidiumjodide in PBS gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door drie wasbeurten met 0,05% Tween 20 in PBS gedurende vijf minuten. Monteer de slide vervolgens in gebufferde glycerol die een Antifade-reagens bevat en dek deze voorzichtig af met een glasdekglaasje. De preparaten kunnen in deze stap enkele maanden worden bewaard bij 4 °C in een luchtdichte container en vervolgens worden afgebeeld en gelokaliseerd met een confocale microscoop.
Hier wordt een microinjectie in een teek getoond met een naald gevuld met kumasi brilliant blue voor de zichtbaarheid. Met een fijne pincet wordt een lichte druk op het lichaam uitgeoefend, waardoor de anale platen gescheiden worden en de anale porie opent voor de microinjectie. Hier wordt het anterieure deel van een darmdivertikel getoond met beberg ferry in de darm.
De darmkernen en spirocheten worden respectievelijk gelabeld met propidiumjodide of fitzy-geconjugeerde anti beberg ferry. We hebben vastgesteld dat, zodra de techniek onder de knie is, 10 tekenen micro-geïnjecteerd kunnen worden met natuurlijk honderdduizend overlevende en met fer geïnfecteerde exemplaren. Hoewel de tekenen onmiddellijk voor andere experimenten kunnen worden gebruikt, wachten we over het algemeen één of twee dagen om er zeker van te zijn dat de tekenen de procedure overleven voordat we verdergaan.
Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u kunstmatig geïnfecteerde teken genereert door middel van micro- en lokale barrière-injecties in de darm van de teek met behulp van confocale immunofluorescentie. Het werken met teken en fijne glazen naalden gevuld met een menselijk pathogeen, zoals Borrelia burgdorferi, kan gevaarlijk zijn tijdens het werk. Wees u bewust van de locatie van de teken en naalden en hanteer te allen tijde voorzorgsmaatregelen voor biosafety level 2.
Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een methode op basis van micro-injectie voor het infecteren van teken met Borrelia burgdorferi, waardoor de benodigde tijd voor de infectie van de teek aanzienlijk wordt verkort. Daarnaast wordt een immunofluorescentietechniek gedemonstreerd voor het lokaliseren van de pathogeen binnen de weefsels van de teek.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Microbiologie
- Vectorbiologie
- Pathogeenlokalisatie
Achtergrond
- De ziekte van Lyme wordt veroorzaakt door de bacterie Borrelia burgdorferi.
- Teken zijn de belangrijkste vectoren voor de overdracht van dit pathogeen.
- Traditionele methoden voor het infecteren van teken zijn tijdrovend.
- Snelle infectiemethoden kunnen de efficiëntie van het onderzoek verbeteren.
Doel van de studie
- Om een snellere methode te ontwikkelen voor het infecteren van teken met B. burgdorferi.
- Om in situ lokalisatie van het pathogeen in tekenweefsels mogelijk te maken.
- Om het begrip van de interacties tussen teken en pathogeen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van glazen capillaire naalden voor micro-injectie.
- Micro-injectie van B. burgdorferi-cellen in de darm van de teek.
- Dissectie van teken om darmweefsels te isoleren.
- Immunofluorescentielabeling van B. burgdorferi in darmweefsels.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle micro-injectie van B. burgdorferi in de darmen van teken.
- Effectieve lokalisatie van het pathogeen aangetoond via immunofluorescentie.
- Resultaten gevisualiseerd met behulp van confocale microscopie.
- Methode vermindert de tijd voor tekeninfectie aanzienlijk.
Conclusies
- De microinjectietechniek is een levensvatbaar alternatief voor de infectie van teken.
- Immunofluorescentie maakt een precieze lokalisatie van pathogenen mogelijk.
- Deze aanpak kan verder onderzoek naar de transmissie van de ziekte van Lyme faciliteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Snelle en gecontroleerde infectie van teekvectoren met Borrelia burgdorferi maakt een efficiënte studie van pathogeen-vectorinteracties mogelijk, wat cruciaal is voor onderzoek naar de ziekte van Lyme. Deze microinjectiebenadering verkort de infectieperiodes van weken naar uren, wat high-throughput screening en mechanistische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase ondersteunt. De methode biedt een reproduceerbare afgifte van pathogenen, waardoor het voorspellend vertrouwen in targetvalidatie en workflows voor assayontwikkeling wordt vergroot.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar interacties tussen Borrelia burgdorferi en de darm van de teek mogelijk om therapeutische doelwitten te valideren die betrokken zijn bij de persistentie en transmissie van het pathogeen.
- Operationele waarde: Zorgt voor gestandaardiseerde pathogenenhoeveelheden over tekencohorten, waardoor variabiliteit in infectiemodellen wordt verminderd en de reproduceerbaarheid van assays wordt verbeterd.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het minimaliseren van risico's bij functionele doelwitten door gecontroleerde blootstelling aan pathogene stammen mogelijk te maken, inclusief stammen die zijn geattenueerd in muismodellen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert geïnfecteerde tekenweefsels die geschikt zijn voor downstream immunofluorescentie- en confocale imaging-assays om de lokalisatie en belasting van pathogenen te kwantificeren.
- Operationele waarde: Levert kwantificeerbare, microscopie-klaar resultaten die standaardisatie van pathogenendetectie-uitlezingen over screeningcampagnes mogelijk maken.
- Schaalbaarheid: Faciliteert de preparatie van grote aantallen uniform geïnfecteerde teken, wat de reproduceerbaarheid van assays en het hergebruik van platforms in vectorgebaseerde screeningplatforms ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Biedt een ziekte-relevant systeem voor het bestuderen van de lokalisatie van Borrelia burgdorferi in de darm van de teek, waardoor in vitro bevindingen worden verbonden met vectorgebaseerde pathofysiologie.
- Mechanistische risicoreductie: Maakt visualisatie van de distributie van pathogenen binnen teekweefsels mogelijk, wat hypotheses over weefselspecifieke virulentiefactoren en transmissiemechanismen onderbouwt.
- Verfijning van preklinische modellen: Ondersteunt risicogestuurde beslissingen over verdere ontwikkeling door een consistente blootstelling aan pathogenen te leveren voor het evalueren van de effectiviteit van interventies in modellen voor door teken overgedragen ziekten.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie tot preklinische evaluatie, door de snelle generatie van geïnfecteerde tekenvectoren en gestandaardiseerde read-outs van pathogenlokalisatie mogelijk te maken.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van interacties tussen pathogeen en vector door gecontroleerde hoeveelheden Borrelia burgdorferi in de darm van de teek te brengen voor mechanistische analyse.
- Screening: Produceert gestandaardiseerde, geïnfecteerde teekweefsels die geschikt zijn voor kwantitatieve immunofluorescentie-assays, wat de reproduceerbaarheid in workflows voor pathogeendetectie verhoogt.
- Analytics: Genereert read-outs op basis van confocale microscopie van de lokalisatie en belasting van het pathogeen, wat vergelijkende analyses tussen experimentele condities en interventies mogelijk maakt.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in vitro pathogeencultuur met lokalisatie in teekweefsel, wat de afstemming van biomarkers en de pathofysiologische relevantie in modellen voor vectoroverdraagbare ziekten ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het infecteren van teken met diverse biologische agentia, waaronder antilichamen en RNAi-reagentia, waardoor de bruikbaarheid wordt uitgebreid voorbij studies naar Borrelia burgdorferi.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in pathogeen-vectorginteracties te verminderen via gelokaliseerde pathogeendetectie.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van tekeninfectiemodellen, waardoor de tijd- en resource-investering afneemt in vergelijking met natuurlijke voedingsmethoden.
- Strategische waarde: Verbetert de efficiëntie van go/no-go-beslissingen in de vroege discoveryfase door snelle, gestandaardiseerde pathogeen-blootstellingsmodellen te bieden voor target-de-risking.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van onderzoeksinitiatieven naar de ziekte van Lyme mogelijk via betrouwbare, high-fidelity infectiemodellen die de biologische variabiliteit verminderen.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in micro-injectietechnieken, het hanteren van teken en confocale immunofluorescentiemicroscopie.
- Is afhankelijk van de bereiding van glazen capillaire naalden, micro-injectie-instrumentatie en de infrastructuur voor fluorescentiemicroscopie.
- Vereist standaardisatie van injectieparameters en darmdissectieprotocollen tussen teams om een consistente aflevering van pathogenen en lokalisatieresultaten te waarborgen.
- Aanpassing aan verschillende tekensoorten of pathogene stammen kan optimalisatie van de naaldgrootte, injectiedruk en bacteriële concentratie vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de technische vaardigheid die nodig is voor een succesvolle micro-injectie en darmdissectie, evenals de noodzaak van biosafety level 2-insluiting bij het hanteren van humane pathogenen.
