Efficiënte polyethyleenglycol (PEG) gemedieerde transformatie van de Moss Physcomitrella patens
19 april 2011
Een eenvoudige en efficiënte methode te transformeren Physcomitrella pantens Protoplasten is beschreven. Deze methode is een bewerking van protocollen voor Physocmitrella Protonemal protoplast en Arabidopsis Bladmoes protoplast transformatie 1.
Het algemene doel van deze procedure is het transformeren van SCO Metre-protoplasten. Dit wordt bereikt door de planten eerst te verteren met Drizly. Vervolgens worden de protoplasten gewassen met mannitol om het drizly te verwijderen, waarna ze worden geïncubeerd met DNA en peg.
Ten slotte worden de getransformeerde protoplasten op platen uitgeplaat en geïncubeerd. Uiteindelijk kunnen de resultaten worden verkregen, die via fluorescentiemicroscopie laten zien dat de getransformeerde protoplasten fluorescent gelabelde eiwitten tot expressie brengen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Y lu, een postdoc uit mijn laboratorium.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze effectief is en consistent protoplasten genereert die het eiwit van belang tot expressie brengen. Om protoplasten van mos te isoleren, begint u met het toevoegen van 9 mL 8% mannitol aan een Petrischaal met behulp van een spatel. Plaats vijf tot zeven dagen oud mos van twee tot drie PP NH 4-platen in de mannitol. Raadpleeg het bijbehorende geschreven protocol voor deze en aanvullende recepten voor reagentia. Voeg vervolgens 3 mL 2% drizly toe en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur onder zachte schudding.
Filter het mengsel door een gaas van 100 micron om een groene homogene suspensie te verkrijgen. Centrifugeer het filtraat vervolgens bij 250 G gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant zeer voorzichtig.
Resuspendeer de protoplasten in 500 µL 8% mannitol. Voeg vervolgens nog eens 9,5 mL 8% mannitol toe. Zorg ervoor dat de protoplasten volledig gesuspendeerd zijn.
Voer de wasstappen nog twee keer uit door de oplossing opnieuw vijf minuten te centrifugeren bij 250 G. Verwijder het supernatant en resuspendeer de protoplasten, eerst in 500 microliters.
Voeg vervolgens 9,5 milliliters 8% mannitol toe en gebruik een hemocytometer. Tel het aantal protoplasten in 10 microliters van de suspensie om DNA in de geïsoleerde protoplasten te transformeren. Centrifugeer eerst het protoplastenmengsel bij 250 G gedurende vijf minuten.
Verwijder het supernatant en resuspendeer de protoplasten in MMG-oplossing tot een concentratie van 1,6 miljoen per milliliter. Incubeer de suspensie gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 600 microliters van de protoplastenoplossing toe aan een cultuurbuis die 60 microgram DNA bevat. Schud goed.
Voeg voorzichtig 700 µL PEG-calciumoplossing toe en schud. Laat het monster gedurende deze wachttijd 30 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Dek de PRMB-platen af met cellofaan.
Verdun vervolgens de suspensie met drie milliliters W5-oplossing en centrifugeer bij 250 G gedurende vijf minuten. Om de PEG te verwijderen, worden de protoplasten opnieuw gesuspendeerd in twee milliliters PRMT; plateer één milliliter per PRMB-plaat bedekt met cellofaan. Bewaar de platen bij 25 °C in een groeikamer.
Verplaats tenslotte, vier dagen na de transformatie, de cellofaan naar nieuwe selectieplaten. Deze figuur toont een voorbeeld van 18 dagen oude planten die zijn geregenereerd uit protoplasten, getransformeerd met 15 µg supercoiled plasmide-DNA dat een hygromycine-resistentiecassette bevat. Hier werden 30 µg van hetzelfde supercoiled plasmide-DNA in protoplasten getransformeerd.
In dit monster werden 60 micrograms plaid DNA getransformeerd. Ten slotte werden deze planten geregenereerd uit protoplasten die waren getransformeerd met 120 micrograms van hetzelfde supercoiled plasma DNA dat de hygromycine-resistentiecassette bevat. De transformatie-efficiëntie wordt niet beïnvloed door DNA-concentraties tot 60 micrograms.
Hogere DNA-concentraties zijn echter nadelig voor deze procedure. De gegevens geven aan dat deze methode consistente resultaten levert over een breed bereik van DNA-hoeveelheden per semester. Deze techniek kan in drie uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.
Na deze procedure kunnen aanvullende methoden, zoals transiënte RNAi en gene knockouts, worden uitgevoerd om verdere vragen over genfunctie te beantwoorden.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een eenvoudige en efficiënte methode voor het transformeren van protoplasten van Physcomitrella patens. De techniek is aangepast op basis van bestaande protocollen voor protoplastentransformatie en is erop gericht om consistent succesvolle resultaten te produceren.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Plantbiologie
- Genetische manipulatie
- Celbiologie
Achtergrond
- Protoplasten zijn plantencellen waarvan de celwanden zijn verwijderd.
- Transformatietechnieken zijn essentieel voor het bestuderen van genfuncties in planten.
- Physcomitrella patens dient als modelorganisme in plantonderzoek.
- Bestaande methoden voor protoplasttransformatie kunnen complex en tijdrovend zijn.
Doel van de studie
- Om een gestroomlijnd protocol te bieden voor de transformatie van Physcomitrella patens protoplasten.
- Om de efficiëntie en betrouwbaarheid van de protoplasttransformatie te verbeteren.
- Om verdere genetische studies in mos te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Verteren van mosweefsel met Drizly om protoplasten te isoleren.
- Wassen van protoplasten met mannitol om contaminanten te verwijderen.
- Transformeren van geïsoleerde protoplasten met DNA met behulp van PEG.
- Incuberen van getransformeerde protoplasten op selectieve media.
Belangrijkste resultaten
- Getransformeerde protoplasten vertoonden een succesvolle expressie van fluorescerende eiwitten.
- De methode vertoonde een consistente transformatie-efficiëntie bij verschillende DNA-concentraties.
- Hogere DNA-concentraties bleken nadelig te zijn voor het succes van de transformatie.
- De gehele procedure kan in ongeveer drie uur worden voltooid.
Conclusies
- Deze methode biedt een betrouwbare aanpak voor de transformatie van Physcomitrella patens protoplasten.
- Het maakt daaropvolgende experimenten mogelijk, zoals transiënte RNAi en gene knockouts.
- Het protocol kan aanzienlijk bijdragen aan het begrijpen van genfuncties in mos.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directieleden
PEG-gemedieerde transformatie van Physcomitrella patens-protoplasten maakt efficiënte en reproduceerbare genoverdracht mogelijk, wat high-throughput functionele genomica in plantensystemen ondersteunt. Deze mogelijkheid is essentieel voor vroege discovery-teams die genfuncties willen onderzoeken, targets willen valideren en de Pathway-elucidatie in een genetisch hanteerbaar model willen versnellen. De schaalbaarheid en het potentieel voor standaardisatie van deze methode maken haar waardevol voor genetische screening op portfolioniveau en mechanistische risicoreductie.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch O&O
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt snelle analyse van genfuncties mogelijk door efficiënte DNA-aflevering in moscellen.
- Ondersteunt hoogfrequente gen-targeting voor functionele validatie van doelwitten en pathway-analyse.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door nauwkeurige genetische modificaties in een modelsysteem mogelijk te maken.
- Verbetert de voorspellende betrouwbaarheid voor daaropvolgende biologische hypothesen.
Screening & assayontwikkeling
- Biedt een gestandaardiseerd protocol voor het genereren van grote aantallen transformanten voor screeningsassays.
- Levert een reproduceerbare transformatie-efficiëntie, wat de betrouwbaarheid en schaalbaarheid van de assay ondersteunt.
- Maakt de preparatie van gevalideerde biologische systemen mogelijk voor verbindingsevaluatie en fenotypische screening.
- Vermindert de afhankelijkheid van gespecialiseerde apparatuur, waardoor de toegankelijkheid voor assay-ontwikkelteams wordt vergroot.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Maakt downstream-applicaties mogelijk, zoals transiënte RNAi- en gene knockout-studies die relevant zijn voor ziekte modellering.
- Ondersteunt de continuïteit van genontdekking tot preklinische validatie in plantgebaseerde systemen.
- Biedt een platform voor translationele biomarker-exploratie wanneer dit is afgestemd op ziekterelateerde pathways.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit transformatieprotocol past binnen het continuüm van vroege ontdekking tot lead-identificatie en maakt genetische manipulatie, target-validatie en assay-ontwikkeling in plantmodellen mogelijk.
- Ontdekkingsbiologie: Faciliteert hypothese-toetsing en pathway-verduidelijking door middel van efficiënte genoverdracht en expressieanalyse.
- Screening: Ondersteunt de assay-gereedheid en reproduceerbaarheid door het genereren van consistente transformantenpopulaties.
- Analytica: Levert kwantitatieve resultaten, zoals transformatie-efficiëntie en eiwitexpressie, voor comparatieve analyse.
- Translationeel onderzoek: Maakt genetische studies mogelijk die bijdragen aan de ontwikkeling van preklinische modellen en de identificatie van biomarkers.
- Bedrijfbrede herbruikbaarheid: Biedt een breed toepasbare, gestandaardiseerde transformatiecapaciteit voor diverse genetische studies.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanische ambiguïteit bij onderzoeken naar genfunctie.
- Operationele waarde: Zorgt voor standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van workflows voor genetische transformatie.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming en kapitaalefficiëntie door het mogelijk maken van robuuste datageneratie in een vroeg stadium.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde prioritering en verdere ontwikkeling van genetische targets en pathways.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in plantencultuur en steriele technieken voor de isolatie en transformatie van protoplasten.
- Heeft toegang nodig tot basis laboratoriuminfrastructuur, inclusief centrifugatie en fluorescentiemicroscopie voor validatie van de resultaten.
- Vereist standaardisatie van transformatieparameters tussen teams voor reproduceerbaarheid over verschillende projecten heen.
- Kan aanpassingen vereisen voor gebruik in andere plantensoorten of modelsystemen buiten Physcomitrella patens.
- De transformatie-efficiëntie is gevoelig voor de DNA-concentratie, waarbij hogere hoeveelheden potentieel nadelig kunnen zijn.
