Detectie van post-translationele modificaties op native Intact Nucleosomen door middel van ELISA

Het algemene doel van deze procedure is om nauwkeurig de relatieve niveaus van posttranslationele modificaties te bepalen binnen preparaten van totale cellulaire nucleosomen, verkregen uit een miljoen cellen. Dit wordt bereikt door eerst hoogwaardige homogene culturen van zoogdiercellen voor te bereiden. Vervolgens worden de kernen uit de cellen geïsoleerd via mechanische disruptie met een Dounce-homogenisator en centrifugatie.

De volgende stap is het verkrijgen van intacte nucleosomen door het chromatine in de kernen te verteren en een reeks hypotone extracties uit te voeren. Tot slot worden de nucleosomen geanalyseerd met behulp van een ELISA-assay met de juiste controles om specifieke post-translationele modificaties te identificeren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de relatieve hoeveelheden van specifieke modificaties in nucleosomenmonsters laten zien.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals western blotting en chromatine-immunoprecipitatie is dat een globaal beeld van een aantal nucleosoommodificatietoestanden gemakkelijk kan worden bepaald. De methode is veel gevoeliger en nauwkeuriger dan western blotting en kan worden uitgevoerd in de meeste laboratoria die zijn uitgerust voor algemene moleculair-biologische experimenten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van stamcellen en epigenetica, zoals wat er gebeurt wanneer belangrijke differentiatie- en herprogrammeringsgebeurtenissen plaatsvinden.

Om de procedure te starten, worden de cellen eerst getrypsiniseerd met drie milliliter trypsine per plaat van 15 centimeter om verse getrypsiniseerde cellen te verkrijgen. Voeg 20 milliliter ijskoude PBS butyraat toe. Breng de cellen over naar een conische buis van 50 milliliter en centrifugeer de buis om de cellen te pelletteren bij 1000 RPM gedurende vijf minuten; aspireer het supernatant en voeg 10 milliliter ijskoude PBS butyraat toe om te wassen. Centrifugeer de celsuspensie opnieuw bij 1000 RPM gedurende vijf minuten.

Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in vier milliliters lysisbuffer met protease-remmers, zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Pipetteer de cellen vervolgens naar een homogenisator met een type B stamper op ijs en homogeniseer met 20 slagen. Breng het homogenisaat daarna over naar een centrifugebuis op ijs.

Centrifugeer het monster bij 2000 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant, dat het cytoplasmatisch materiaal bevat, en resuspendeer.

Suspendeer het pellet in twee milliliter ijskoud washbuffer C met protease-remmers en breng het resuspendeerde materiaal voorzichtig aan als laag over een kussen van vijf milliliter 30% sucrose in een koude centrifugebuis. Centrifugeer om de kernen te isoleren bij 2.400 G gedurende vijf minuten in een swinging-bucket rotor; de kernen zullen door het kussen migreren en celresten blijven op de interface. Verwijder na centrifugatie voorzichtig het volledige vloeistofvolume en suspendeer de kernen opnieuw in 250 microliter ijskoud washbuffer C met protease-remmers, waarna de kernen worden overgebracht naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.

Om te beginnen met de isolatie van nucleosomen, voegt u drie µL 0,1 M calciumchloride toe aan de kernen en plaatst u deze in een heatblock van 37 °C totdat de temperatuur is geëquilibreerd. Voeg vervolgens twee eenheden micrococcal nuclease toe in 10 µL micrococcal nuclease-buffer en incubeer dit gedurende 12 minuten bij 37 °C. Meng regelmatig met een pipetpunt.

Stop na de incubatie de reactie met zes µL 0,5 M natrium-EDTA-pH 8 en plaats het op ijs om af te koelen. Centrifugeer vervolgens het monster 4 minuten bij 2000 ×g; verwijder na centrifugatie de supernatant en resuspendeer de pellet in 300 µL 0,2 mM natrium-EDTA. Incubeer het monster gedurende één uur op ijs, waarbij af en toe voorzichtig wordt gepipetteerd om te mengen.

Na centrifugatie bij 3000 G gedurende vier minuten bij vier graden Celsius, wordt het supernatant, dat de vrije nucleosomen bevat, verzameld in een nieuwe centrifugebuis en op ijs bewaard voor later gebruik van extra nucleosomen. Suspendeer de pellet in 300 µL 0,2 mM natrium-EDTA zoals voorheen en incubeer dit gedurende één uur op ijs met af en toe voorzichtig mengen.

Centrifuge het monster na de incubatie. Combineer de resulterende supernatant opnieuw met het resterende monster in de microcentrifugebuis op ijs. Om de nucleosoom-ELISA-assay te starten, vult u een 96-well ELISA-plaat met een aflopende reeks van vijf tweevoudige seriële verdunningen van nucleosomen en coatingbuffer, beginnend met 0,1 µg per 50 µL in de bovenste well; alle verdunningsreeksen moeten in triplikaat worden geladen.

Vergeet niet om wells met alleen coatingbuffer als controles op te nemen. Incubeer de plaat overnacht bij vier graden Celsius tot de volgende dag. Gebruik een plaatwasser om de platen vier keer te wassen met 200 microliters per well van 0,5% Tween 20 in PBS bij kamertemperatuur, voor een totale duur van 10 minuten.

Voeg nu 100 µL blokkeeroplossing per well toe en incubeer dit gedurende één uur bij kamertemperatuur op een rotator. Verwijder na de incubatie de blokkeerbuffer door de omgekeerde plaat krachtig boven een gootsteen te schudden. Voeg vervolgens de verdunde primaire antistof toe in een volume van 50 µL per well in een oplossing van 5% PSA in 0,05% Tween 20 in PBS en incubeer de oplossing gedurende één uur op een rotator bij kamertemperatuur.

Was na de incubatie met het primaire antilichaam de platen zoals voorheen met de plaatwasser. Zodra de wasprocedure is voltooid, voegt u per put 50 µL toe van het met mierikswortelperoxidase geconjugeerde secundaire antilichaam, verdund in PBS met 5%BS, A, en 0.5%20. Na de incubatie met het secundaire antilichaam volgt een incubatie van één uur bij kamertemperatuur op een rotator. Was de platen zoals voorheen.

Gebruik de plaatwasser om de plaat te ontwikkelen. Voeg 50 µL TMB Eliza-substraat toe aan elke put en laat dit 10 minuten incuberen. Bij kamertemperatuur zullen de putten van de ELIZA-plaat blauw kleuren en is de intensiteit proportioneel aan de hoeveelheid nucleosoommodificaties die in elke put aanwezig zijn.

Stop vervolgens de reactie door 50 µL per well van 2N zwavelzuur toe te voegen. De kleur zal veranderen naar bruin; centrifugeer de plaat vervolgens 2 minuten bij 1500 RPM om eventuele luchtbellen te verwijderen.

De plaat is nu klaar voor kwantificering op een colorimetrische platenlezer. Lees tot slot de plaat af bij 450 nanometer en exporteer de resultaten voor analyse. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in twee dagen worden voltooid indien deze na de ontwikkelingsfase correct wordt uitgevoerd.

Deze techniek opende de deur voor onderzoekers in het veld van stamcelonderzoek om epigenetische responsen op differentiatie- en herprogrammeringsprocessen te onderzoeken op het niveau van het volledige epi-proteoom.